肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT1)检测试剂盒 ; 50管/48样
测定意义：
肉毒碱棕榈酰转移酶是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶 A 将酰基转移至 L-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸
通过线粒体内膜的过程中起重要作用。
测定原理：
基于肉碱和脂酰辅酶 A 在丙二酰辅酶 A 存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)的作用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶
A(COA-SH) ，与 Ellman 试剂 DN-TB 反应后，产生黄色的 TNB。通过其吸收峰值得变化（412nm），来定量分析 CPT-1 的活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 55mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆液于 600g ，4℃离心 5min
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g ，4℃离心 10min。
4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CPT-1（此步可选做）。
5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W ，超声3秒，间隔10秒，重复30次），
用于线粒体CPT-1测定。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
(1) 在试剂五中加入2mL无水乙醇，混匀，再加入44m试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的
试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
(2) 在试剂六中加入 2mL 蒸馏水，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反
复冻融；
(3) 在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 样本、880μL 试剂五和40μL 试剂六，混匀，记录 412nm 处 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20
秒时的吸光度 A2 ，计算 ΔA=A2-A1。
CPT-1活性计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CPT-1 （nmol/min/mg prot）＝ [ΔA×V 反
总÷(ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT-1（nmol/min/g鲜重）=[ΔA×V反总÷(ε×d）×10⁹]÷（W×V 样÷V样总）÷T=177.8×ΔA÷W。
3、按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。CPT-1（nmol/min/10⁴cell）=
[ΔA×V 反总÷(ε×d）×10⁹]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.3556×ΔA。V 反总：反应体系总体积，9.6×10-⁴L；ε：TNB 摩尔消光
系数，1.36×10⁴L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加 入样 本体积，0.04 mL；V 样总：加入提取液体积0.202mL；
T：反应时间，2 min ；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500： 细胞或细菌总数，500万。
