过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒 ; 100管/48样

过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒 ; 100管/48样

测定意义： 

CAT(EC 1. 11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的 H2O2  清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

测定原理： 

过氧化氢能氧化 MoO42-成 MoO52-,MoO52-接受氢氧根的电子成键，分子间立即脱水缩合，得到稳定的黄色复合物(H2MoO4 ·XH2O)n 在 405nm处有强烈吸收峰，其吸光值和过氧化氢浓度成线性关系。测定出体系剩余过氧化氢在405nm的吸光值即可反映 CAT 的催化活性。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100 mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体5 mL×1瓶，4℃避光保存；

试剂二：液体15 mL×1瓶，常温保存；（过饱和试剂，如有结晶析出，可 37℃加热搅拌溶解）试剂三：

液体30 mL×1瓶，4℃保存；(过饱和试剂，如有絮状沉淀，可 37℃加热搅拌溶解)

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~ 1000：1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1 ：5~ 10 的比例（建议称取约0. 1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、 酶标仪预热30min 以上，调节波长至 405 nm。

2、在EP 管中加入下列试剂

CAT 活性计算：

1、标准曲线：

y = 0. 1x + 0.0013R2 = 1x：体系中过氧化氢浓度变化值(μmol/mL）y：吸光值差值A

2、血清（浆）CAT活力的计算:

     单位的定义：

     每毫升血清（浆）每分钟催化 1 μmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。CAT( μmol /min/mL)= =( A-0.0013)÷0. 1×V反总÷V

     样÷T=8.9×( A-0.0013)

3、组织、细菌或细胞中CAT活力计算：

(1）按样本蛋白浓度计算：

      单位的定义：

      每mg组织蛋白每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。CAT( μmol/min/mg prot)=( A-0.0013)÷0. 1×V  反总÷(V

      样×Cpr) ÷T=8.9×( A-0.0013)÷Cpr

(2）按样本鲜重计算：

      单位的定义：

      每g组织每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。 CAT( μmol/min/g鲜重)=( A-0.0013)÷0. 1×V  反总÷（W× V 样

     ÷V 样总）÷    T=8.9×( A-0.0013)÷WV反总：反应体系总体积，0.445 mL；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液

      体积，1 mL；T：反应时间，10 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。

注意事项：

1、预实验若发现酶活性过高（A 测定＜0. 1），可用提取液适当稀释样品后测定，并在计算公式中乘以相应稀释倍数。

2、若A对照＜A 测定，一方面可能是酶活性过低，可将反应时间10延长到 30min,另一方面可能样本中杂质干扰严重，可将样本稀释 5 倍左右后测定，并在计算公式中代入实际反应时间和乘以相应稀释倍数。