磷脂酶D(PLD)检测试剂盒 ; 100T/96S
测定意义：
磷脂酶 D（EC3.1.4.4 ）即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。
测定原理：
磷脂酶 D 催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将 4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm 处有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品：
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 102mL× 1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 3mL × 1 瓶，4℃避光保存。
试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1mL 无水乙醇充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。
标准品：液体 1mL×1 支，4℃避光保存。
酶液提取：
1、组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g ，加入 1mL 提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃, 10000g 离心 5min ，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min ，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。
2、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后于4℃ , 10000g离心 5min ，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。
3、血清：直接测定。
测定操作：
| 空白管 | 标准管 | 测定管 |
试剂一 (μL） | 20 | | |
试剂二 (μL） | 30 | 30 | 30 |
试剂二(μL） | | 20 | |
标准品(μL） | | | 20 |
试剂三(μL） | 10 | 10 | 10 |
充分混匀，30℃反应 30min ，沸水浴 10min，打开盖子， 自然冷却 2min |
试剂四(μL） | 140 | 140 | 140 |
30℃反应30min，于微量石英比色皿/96 孔板，空白管调零，测定 500nm 处吸光值，分别记为 A 标准管和 A 测定管。 |
酶活计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、按照蛋白浓度计算：
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
2、按照样本质量计算：
每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1mol 胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
3、按照细胞数量计算：
酶活性定义：每 10⁴个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
4、按照液体体积计算：
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
C 标准：标准品浓度，500nmol/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T：反应时间，30min
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1、按照蛋白浓度计算：
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
2、按照样本质量计算：
酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶
活力单位。
3、按照细胞数量计算：
酶活性定义：每 10⁴个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量一个酶活力单位。
4、按照液体体积计算：
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
C 标准：标准品浓度，500nmol/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T：反应时间，30min
注意事项：
1、显色完成后，若有沉淀，于 8000rpm ，25℃离心 5min 后取上清测定。
2、吸光值不宜超过 1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。
