丙酮酸羧化酶(PC)检测试剂盒 ; 100管/96样
测定意义：
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase ，PC ，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，催化丙酮酸、ATP 、CO2 和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，是糖异生过程的第一个限速酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。
测定原理：
PC 催化丙酮酸、ATP 、CO2 和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和 NADH生成苹果酸和 NAD+ ，在 340nm 下测定 NADH 氧化速率，即可反映 PC 活性。
需自备的仪器和用品：
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 18 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 13uL×1 支，4℃保存；
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；
样本的前处理：
1、组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
2、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
3、将匀浆 600g ，4℃离心 5min。
4、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g ，4℃离心 10min。
5、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PC（此步可选做）。
6、在步骤④的沉淀中加入 1mL 提取液，超声波破碎(冰浴，功率 20％或 200W ，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次)，用于线粒体 PC 活性测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四的配制：在试剂四瓶中加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
2、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL 样本、10μL试剂四和180μL 工作液，立即混匀，记录340nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2 ，计算 ΔA=A1-A2。
PC 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单 位。
PC(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×10⁹]÷(V ×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min /g鲜重)＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 总)÷T=1608×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min /10⁴cell)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d))×10⁹]÷(500×V 样÷总)÷T=3.215×ΔAV反总：反应体系总体积,2×10-4 L;ε;NADH摩尔消光系数, 6.22×10³ L / mol/cmd：比色皿光径, 1cm;V 样：加入样本体 积, 0.01 mL;V 样总：加入提取液积,1mL;T：反应时间,2min;Cpr：样本蛋白质浓 度,mg/mL;W：样本质量，g;500：细菌或细胞总数,500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=3216×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷总)÷T=6.43×ΔAV反 总：反应体系总体积,2×10-4 L;ε ：NADH 摩尔消光 系数，6.22×10³ L /mol/cmd96孔板光径，0.5cm;V 样：加入样本体积,0.01 mL;V 样总：加入提取液体积,1mL;T：反应时间，2 min;Cpr：样本
蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g;500：细菌或细胞总数,500万。
注 意：
在该试剂盒中，若 ΔA大于0.5 ，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于 0.5可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
