乙酰辅酶A羧化酶(ACC)检测试剂盒 ; 100管/48样

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)检测试剂盒 ; 100管/48样

测定意义： 

ACC在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

测定原理： 

ACC 能够催化乙酰辅酶 A、NaHCO3 和ATP 生成丙二酰辅酶 A、ATP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 ACC 活性。

需自备的仪器和用品：

分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：10mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶， 4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。

试剂五：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。

试剂六：液体 25mL×1 瓶，室温保存。

试剂七：10μmol/mL标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s ，间隔 10s ，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。

2、酶促反应试剂的配制和预热：在试剂二瓶中加入2.5mL试剂一，充分溶解混匀；在试剂三瓶中加入2mL蒸馏水，充分溶解混匀；将试剂一、二、三在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。

3、定磷试剂的配制：按 H₂O:  试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1  的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配

4、0.5μmol/mL  标准磷应用液配制：将试剂七20倍稀释，即取 0.5mL 试剂七加9.5蒸馏水，充分混匀

5、酶促反应

6、定磷

ACC活性计算：

1、按组织蛋白浓度计算：

     定义：

     每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

     ACC (μmol/h/mg prot)=(C标准管×V 总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(V 样×Cpr)÷T=10×(A 测定管-A对照管)÷

     (A标准管-A空白管)÷Cpr

2、按样本鲜重计算：

     定义：

     每小时每 g 组织产生1μmol 无机磷的量为一个ACC活力单位。

     ACC (μmol/h/g 鲜重)=(C标准管×V总)×(A测定管-A 对照管)÷(A标准管-A空白管)×V 总÷(W× V 样÷V样总)÷T=10×(A测定管-A

     对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

     定义：

     每小时每 500 万细菌或细胞产生 1μmol 无机磷的量为一个ACC活力单位。

     ACC (μmol/h/10⁴cell)=(C 标准管×V总)×(A 测定管-A对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(500× V 样÷V 样总)÷T=0.02×(A测定管-

     A对照管)÷(A 标准管-A 空白管)C标准管:标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.1mL；V 样：加入样本体 积，

     0.01mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500:

     细菌或细胞总数，500万。

注 意：

1、配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

2、若测定管吸光值大于 2，将样品用提取液稀释适当倍数后再进行测定，使吸光值小于2，可提高检测灵敏度，计算公式乘以相应稀释倍数。