果糖1,6二磷酸酶(FBP)/果糖1,6二磷酸酯酶检测试剂盒 ; 50管/48样

果糖1,6二磷酸酶(FBP)/果糖1,6二磷酸酯酶检测试剂盒 ; 50管/48样

测定意义： 

果糖-1,6 二磷酸酶又称果糖 1,6 二磷酸酯酶，催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和无机磷，在糖的异生代谢和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。

测定原理： 

FBP催化1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和无机磷，在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH 340nm下测定 NADPH 增加速率，即可计算 FBP活性。

需自备的仪器和用品：

分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶， -20℃保存；临用前加入 40mL 试剂四充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

试剂二：液体 18μL×1 瓶，4℃保存；临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶， -20℃保存；临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

试剂四：液体 50mL×1 瓶， 4℃保存；

样本的前处理：

①总FBP酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W ，破3s ，间歇7s ，总时间1min），然后 4℃ , 8000g 离心10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体 FBP 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5～10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃ , 200g 离心 5min ，弃沉淀，取上清在 4℃ , 8000g离心 10min ，取上清用于测定胞浆 FBP 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴， 200W，破碎 3s ，间歇 7s ，总时间 1min），然后 4℃ , 8000g 离心 10min ，取上清测定叶绿体中 FBP 酶活性。建议测定总 FBP 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBP ，则按照步骤②提取粗酶液。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一、二、三 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。

3、加样表：

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，立即混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，在340nm波长下记录反应1min后吸光度A1和反应6min 后的吸光度A2，计算 ΔA=A2-A1

FBP 活性计算：

(1)  按样本蛋白浓度计算

       单位的定义：

       每mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

       FBP(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样 ×Cpr)样 ×Cpr)÷T 样 ×Cpr)÷T=321.5×ΔA÷Cpr。

(2)  按样本鲜重计算

      单位的定义：

      每g组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

      FBP(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V样总) ÷T=321.5×ΔA÷WV 反总：反应体系总体积 ,1×10-3L;

      ε:NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.1 mL;V 样总:加入提取液体,积1mL;T: 

      反应时间,5 min;Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W:样本质量,g。