磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)检测试剂盒 ; 100管/96样
测定意义：
PEPCK（EC4.1.1.32）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，是调节糖异生途径的关键酶。
测定原理：
PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和 CO₂ ，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD⁺ ，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PEPCK 活性。
需自备的仪器和用品：
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 18 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：液体 16.5uL×1 支，4℃保存；
试剂三：粉剂×1支， -20℃保存；
试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；
样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W ，超声 3s ，间隔 10s ，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、试剂四的配制：临用前加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
4、将工作液和试剂四置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟。
5、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入10μL 样本、10μL 试剂四和 180μL 工作液，立即混匀，记录 340nm处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2 ，计算 ΔA=A1-A2。
PEPCK 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）PEPCK 活力计算
单位定义：
每毫升血清(浆)每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 PEPCK(nmol/min/mL))＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷
T= 3215×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PEPCK 活力计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：
每mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位定义：
每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=3215×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算：
单位定义：
每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V 反总÷ (ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.43×ΔAV 反总:反应体系总体积,2×10-⁴ L；
ε:NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d:比色皿光径,1cm；V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总：加入提取液体
积，1mL；T：反应时间,1min；Cpr：样本蛋白质浓度,mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b. 用96孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)PEPCK 活力计算
单位定义：
每毫升血清(浆)每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位> PEPCK(nmol/min/mL))＝[ΔA×V反总÷(ε×d) ×10⁹] ÷V 样÷
T=6430×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PEPCK 活力计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：
每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位定义：
每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=6430×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位定义：
每1万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=12.86×ΔAV 反总:反应体系总体积,2×10-4 L,
ε:NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L / mol /cm；d：96 孔板光径, 0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL;V 样总:加入提取液
体积,1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万
注 意：
在该试剂盒中，若 ΔA 大于 0.1 ，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使 ΔA 小于 0.1 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
