测定意义：
蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。
测定原理：
羰基与2,4-二硝基苯肼反应生成红色2,4-二硝基苯腙，在370nm处有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品：
天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯。
试剂的组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂0.1g×5 支，4℃避光保存。（使用前根据样品数，每支加1mL水溶解，每支为10个样品用量）
试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体15mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。
试剂六：液体60mL×1瓶，4℃保存。
样品处理：
1、组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液）进行冰浴匀浆，于 4℃ , 4000g 离心 10min ，取上清，加入 0.1mL 试剂一，室温放置 10min ，4 ℃, 10000g 离心 10min，取上清待测。
2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000 ：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液）， 冰浴超声波破碎细胞（功率300w ，超声3秒， 间隔7秒，总时间3min）； 然后10000g ，4℃, 离心10min，取上清置于冰上待测。
3、血清等液体样本：直接测定。
测定步骤和操作表：
1、分光光度计/酶标仪预热30min ，调节波长至370nm。
2、操作表
| 对照管 | 测定管 |
样品(μL） | 60 | 60 |
试剂二(μL） | | 0.4 |
试剂三(μL） | 120 | |
混匀，37℃避光反应 1h |
试剂四(μL） | 150 | 120 |
静置 5min ，4℃, 12000g 离心 15min，弃上清，留沉淀 |
试剂五(mL） | 150 | 150 |
漩涡混匀，4℃, 12000g 离心 10min，弃上清，留沉淀 |
试剂五(μL） | 300 | 300 |
漩涡混匀，4℃, 12000g 离心 10min，弃上清，留沉淀 |
试剂五(μL） | 300 | 300 |
漩涡混匀，4℃, 12000g 离心 10min，弃上清，留沉淀 |
试剂六(μL） | 300 | 3000 |
漩涡混匀，37℃温育15min ，沉淀全部溶解后，4℃ , 12000g 离心15min ，取上清200μL于微量石英比色皿/96孔板中，测定A370 。ΔA=A测定管-A对照管 |
计算公式：
a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、按照样本蛋白浓度计算
蛋白质羰基含量(μmol/mg prot）= [ΔA370×V反总÷ (ε×d）]÷(V样×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr
2、按照样本重量计算
蛋白质羰基含量(μmol/g鲜重）= [ΔA370×V反总÷ (ε×d）]÷(W×V样÷V样总) =0.227×ΔA370÷W
3、按照细胞数量计算
蛋白质羰基含量(μmol/10⁴cell）= [ΔA370×V反总÷ (ε×d）]÷(细胞数量 ×V样÷V 总)=0.227×ΔA370÷ 细胞数量
4、按照液体体积计算
蛋白质羰基含量(μmol/mL）= [ΔA370×V反总÷ (ε×d）]÷V样=0.227×ΔA370V 反总：反应体系总体积，0.3mL；ε ：羰基毫摩
尔消光系数，22L/mmol/cm ；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.06 mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr
：样本蛋白质浓度，mg/mL ，W：样本质量，g
b．用96孔板测定的计算公式如下
1、按照样本蛋白浓度计算
蛋白质羰基含量(μmol/mg prot）= [ΔA370×V反总÷ (ε×d）]÷(V 样×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr
2、按照样本重量计算
蛋白质羰基含量(μmol/g鲜重）= [ΔA370×V反总÷ (ε×d）]÷(W×V样÷V样总) =0.454×ΔA370÷W
3、按照细胞数量计算
蛋白质羰基含量(μmol/10⁴cell）= [ΔA370×V 反总÷ (ε×d）]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总) =0.454×ΔA370÷细胞数量4. 按照液
体体积计算蛋白质羰基含量(μmol/mL）= [ΔA370×V反总÷ (ε×d）]÷V样=0.454×ΔA370V 反总：反应体系总体积，0.3mL；ε
:羰基毫摩尔消光系数，22L/mmol/cm ；d：96 孔板光径，0.5cm ；V样：加入样本体积，0.06 mL；V样总：加入提取液体积,
1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL ，W：样本质量，g
注意事项：
1、试剂一使用之前根据要测定的样品数现配，配置好后 4℃保存，若变为黑色，则不能使用。
2、试剂二见光易分解，反应需严格避光。
