脱氢酶(DHA)检测试剂盒 ; 100管/96样
测定意义：
脱氢酶(dehydrogenase, DHA) 是一类催化物质氧化还原反应的酶，催化底物通过细胞色素系统被氧化，释放的能量供机体使用，是生物体取得能量的一种方式。
测定原理：
在细胞呼吸过程中，氢受体 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脱氢酶作用下接受氢以后，被还原为三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF 呈现红色，于 485nm 测定其吸光值，即得脱氢酶活性。
自备实验用品及仪器：
筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、冰、蒸馏水、甲醇（不允许快递，请用户自备）。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1瓶，4℃保存
试剂一：粉剂×1瓶，使用前加10mL 试剂二溶解，4℃避光保存（尽量现配现用）。
试剂二：液体 20mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：甲醇，自备。
样品处理：
1. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液）， 冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3 秒， 间隔 7 秒，总时间 3min）； 然后8000g ，4℃ , 离心 10min，取上清置于冰上待测。
2. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 8000g ，4℃, 离心 20min。
3. 液体：直接检测。
测定步骤和操作表：
| 空白管 | 测定管 |
样本(μL） | | 100 |
蒸馏水(μL） | 100 | |
试剂一 (μL） | | 100 |
试剂二(μL） | 100 | |
充分混匀，37℃培养 24h |
试剂三(μL） | 900 | 900 |
振荡 1h ，8000g ，25℃ , 离心 5min ，取 200μL 上清于微量石英比色皿/96 孔板，测定 A485，△A=A 测定-A空白管。空白管只要做一管。 |
脱氢酶活力计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0422x - 0.0312 ；R²= 0.9988；x 为标准品浓度(μg/mL），y 为吸光值。
1. 按照蛋白浓度计算
酶活单位定义：
在 37℃时，每mg蛋白样品每 min 催化产生 1μgTF 为一个酶活性单位。
DHA(μg/min /mg prot）=(△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 0.181×(△A+0.0312)÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：
在 37℃时，每克样品每 min 催化产生 1μgTF 为一个酶活性单位。
DHA(μg/min/g鲜重)= (△A+0.0312)÷ 0.0422×V 反总÷(W×V 样÷V 样T= 0.181×(△A+0.0312） ÷W
3. 按液体体积计算
酶活单位定义：
在 37℃时，每 mL 样本每 min 催化产生 1μgTF 为一个酶活性单位。
DHA (μg/ min /mL）= (△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反总÷V 样÷T= 0.181×(△A+0.0312）
V 反总：反应总体积，1.1mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；T：培养时间，1d=1440min
W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL。
b. 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.0211x - 0.0312 ；R² = 0.9988；x 为标准品浓度(μg/mL），y 为吸光值。
1. 按照蛋白浓度计算
酶活单位定义：
在 37℃时，每 mg 蛋白样品每 min 催化产生 1μgTF 为一个酶活性单位。
DHA(μg/min/mgprot）=(△A+0.0312)÷ 0.0211×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 0.362×(△A+0.0312) ÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：
在 37℃时，每克样品每 min 催化产生 1μgTF 为一个酶活性单位。
DHA(μg/min /g鲜重)=(△A+0.0312)÷ 0.0211×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=0.362×(△A+0.0312）÷W
3. 按液体体积计算
酶活单位定义：
在 37℃时，每 mL 样本每 min 催化产生 1μgTF 为一个酶活性单位。
DHA(μg/ min /mL)= (△A+0.0312)÷ 0.0211×V 反总÷V 样÷T= 0.362×(△A+0.0312)V 反总：反应总体积
1.1mLV样：加入反应体系中样本体积0.1mL,T培养时间,1d=1440minW：样品质量gCpr蛋白浓度mg/mL。
注意事项：
配制好的试剂一避光保存于 4℃,最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用。
