多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒 ; 100管/48样
测定意义：
PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
测定原理：
PPO 能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏。
试剂组成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：20mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：5mL×1瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000 ：1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s ，间隔10s ，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1 ：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）或果汁样本的处理：
按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为1 ：5~10的比例（建议取0.1mL 血清（浆）或果汁加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）
试剂名称(μL） | 测定管 | 对照管 |
样本 | 50 | |
煮沸的样本 | | 50 |
试剂一 | 200 | 200 |
试剂二 | 50 | |
蒸馏水 | | 50 |
37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，95℃水浴5min ，冷却至室温，10000g ，25℃离心10min，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。 |
注 意：煮沸样本的操作：取300μL离心上清于EP管中，进行5min95℃水浴处理；每个测定管需要设一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行 5min95℃水浴处理。
PPO 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）或果汁PPO活性
单位的定义：
每分钟每mL血清（浆）或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO（U/mL）=ΔA×V 反总÷(V液× V样÷V样总)÷0.01÷T=60×ΔA÷V液
2、组织、细菌或细胞PPO活性
(1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化 0.01为一个酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T=60×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2）按样本鲜重计算：
单位定义：
每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO（U/g鲜重）=ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.01÷T=60×ΔA÷W
(3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：
每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。PPO（U/10⁴cell）=ΔA×V反总
÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.12×ΔAV 反总：反应体系总体积，0.3mL；V液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1mL； V样：
加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质
量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）或果汁PPO活性
单位的定义：
每分钟每mL血清（浆）或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
PPO（U/mL）=ΔA×V反总÷(V液×V样÷V 样总)÷0.005÷T=120×ΔA÷V液
2、组织、细菌或细胞PPO活性
(1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2）按样本鲜重计算：
单位定义：
每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
PPO（U/g鲜重）=ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.005÷T =120×ΔA÷W
(3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：
每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化 0.005 为一个酶活力单位。
PPO（U/10⁴cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T=0.24×ΔAV反总：反应体系总体积，0.3mL；V液：加入血清
（浆）或果汁体积，0.1mL； V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本
蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
