测定意义:
TAL广泛存在于植物和微生物中,是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。TAL能够跃过肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)直接将酪氨酸转化为香豆酸,香豆酸可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素 类天然产物。
测定原理:
TAL能够分解酪氨酸产生香豆酸,使反应溶液333nm下的吸光度随反应时间而上升,根据吸光度的变化率可计算出TAL活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体60mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×2瓶,4℃保存;
试剂三:液体5mL×1瓶,4℃保存;
粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次); 8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1 :5~10 的比例(建议称取约 0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)果汁等液体样品:直接检测。
测定步骤
试剂名称(μL) | 空白管 | 测定管 |
样本上清 | 100 | 100 |
试剂一 | | 900 |
试剂二 | 900 | |
充分混匀,40℃保温60min |
试剂三 | 50 | 50 |
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至333nm,蒸馏水调零。
2、试剂二的配置:临用前在试剂二瓶中加入15mL试剂一充分溶解待用(用不完的试剂 4℃ 保存一周,注意:现配现用),在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴10min 以上。
3、在EP管中依次加入如下试剂混匀,10000g4℃离心5min,取0.8~1mL上清至1mL石英比色皿,333nm下测定吸光值A测定与A对照,ΔA=A测定-A对照。
TAL活性计算:
1、血清(浆)或果汁TAL活性
单位的定义:
每分钟每mL血清(浆)或果汁在每mL反应体系中使 333nm 处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
TAL(U/mL)= ΔA×V反总÷( V样÷V样总)÷0.01÷T =17.5 × ΔA
(2)按样本鲜重计算:
单位定义:
每分钟每g组织在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
TAL(U/g鲜重)= ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.01÷T=17.5×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位定义:
每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化0.01 为一个酶活力单位。
TAL(U/10⁴cell)= ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =0.035×ΔAV 反总:反应体系总体积,1.05mL;V样:加入样本
体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,60min ;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;
500:细胞或细菌总数,500万。