异柠檬酸裂解酶(ICL)检测试剂盒 ; 50管/48样
测定意义：
ICL（EC4.1.3.1 ）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL 是乙醛酸循环的关键酶之一。
测定原理：
ICL 催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH 在 LDH 的作用下生成乙醇和 NAD ，NADH 在340nm 下有特征吸收峰，监测 340nm 吸光度的减小速率可间接反应 ICL 活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×3 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂仍-20℃保存；
试剂四：粉剂×3 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂五：液体800 μL×2支，4℃保存；临用前每支加入560 μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂
试剂六：粉剂×3瓶，4℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分混匀待用。用不完的试剂-20℃保存；
样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复30次）；15000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
试剂 | 测定管 |
试剂一 (μL） | 300 |
试剂二(μL） | 250 |
试剂三(μL） | 300 |
试剂四(μL） | 300 |
试剂五(μL） | 20 |
样本(μL） | 20 |
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min将上述试剂按顺序加入1mL玻璃比色皿中，加试剂六的同时开始计时，在340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2分20秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。 |
注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四、五和样本按比例配成混合液，
在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min以上，测定时加入1220µL混合液和 300µL试剂六测定。
ICL 活性计算：
(1) 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：
每mg组织蛋白中每分钟消耗1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。
ICL（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷(ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=2443×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算：
单位的定义：
每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
ICL（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷(ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T=2443×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：
每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL（nmol/min /10⁴ cell）=
[ΔA×V反总÷(ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=4.886×ΔAV 反总：反应体系总体积，1.52×10-3 L；
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05
mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质
量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
