细胞分裂素氧化酶(CKO/CKK)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
细胞分裂素氧化酶(CKO/CKX,EC 1.5.99.12)既能特异性催化细胞分裂素类异戊二烯侧链的不饱和键，又能控制 CK 的合成与降解以稳定植物体内 CK 的含量，是目前发现的唯一可促进内源 CK 降解的关键酶。
细胞分裂素氧化酶 (CKO/CKX) 催化底物进一步还原2,6-二氯酚靛酚(DCPIP), 使该物质在600nm 处的吸光值减小，通过检测600nm 处的下降速率进而得到 CKO/CKX 酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，再加1.1mL蒸馏水溶解，并用蒸馏水稀释5倍待用。 |
试剂二 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，再加1.1mL无水乙醇溶解待用。 |
试剂三 | 液体28mL×1瓶 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、可调式移液器、低温离心机、研钵。
细胞分裂素氧化酶( CKO/CKX)活性测定 ：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本
取约0.2g 组织(水分充足的样本可取0.5g), 加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，4℃×12000rpm离心15min, 取上清液待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例提取。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至600nm, 蒸馏水调零，所有试剂解冻至室温(25℃)。
② 在1mL玻璃比色皿(光径1cm) 中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
试剂一 | 20 |
试剂二 | 20 |
试剂三 | 560 |
混匀，室温(25℃)下，10s时立即于600nm处读取A1,5min后读取A2,△A=A1-A2。 |
注 :
1 、若A1值小于0.3,则可减少样本加样体积 V1 (如减至40μL,试剂三相应增加),则改变后的V1 需代入计算公式重新算。
2、若△A 的值在零附近徘徊，可增加样本加样体积 V1 (如增至200μL,试剂三相应减少), 或延长反应时间 T ( 如 由5min后读 A2 延至10min), 则改变后的 V1 和 T 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每分钟还原1nmol 的2,6-二氯酚靛酚 (DCPIP) 为一个酶活力单位。
CKO/CKX 活力(nmol/min/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V2×10°]÷(V1×Cpr)÷T=66.67×△A÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每克组织每分钟还原1nmol 的2,6-二氯酚靛酚 (DCPIP) 定义为一个酶活力单位。
CKO/CKX 活力(nmol/min/g鲜重)=[△A÷(E×d)×V2×10°]÷(W×V1÷V)÷T=66.67×△A÷ W
S---2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm;d--- 光径， 1cm;
V---加入提取液体积，1mL;V¹--- 加入样本体积，0.1mL;
V2---反应体系总体积，7×10-4 L;T--- 反应时间，5min;
W--- 样本质量，g;500-- 细胞或细菌总数，500万；
Cpr--- 样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
