总抗坏血酸(TAA)含量测定(红菲咯啉法)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
总抗坏血酸 (TAA) 包括还原型和脱氢型抗坏血酸，其中脱氢抗坏血酸被还原为还原型抗坏血酸，接着还原型抗坏血酸把三价铁离子还原成二价铁离子，二价铁离子与红菲咯啉反应生成红色络和物，在534nm 处有特征吸收峰，颜色深浅与还原型抗坏血酸含量成正比，继而计算得出总抗坏血酸的含量。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂a | 液体2.5mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂b | 液体20mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂c | 液体5mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | A:液体×1支 试剂瓶B(空瓶) | 4℃保存 | 试剂二B液配制：临用前取0.024mLA液至试剂瓶B中，再加4.976mL无水乙醇，混匀备用。 |
试剂三 | 粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下使粉体落入底部，再加10mL无水乙醇混匀溶解(该试剂难溶，可超声溶解 |
试剂四 | 液体5mL×1瓶 | 4℃保存 | 溶液为淡黄色。 |
标准品 | 粉剂×2支 | -20℃保存 | 临用前：每支用前甩几下标准品管，使粉剂落入底部，加入1mL试剂一混匀溶解，即得1mg/mL,再用试剂一稀释100倍为0.01mg/mL溶液即为标准液(现配现用) |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、 研钵、冰、低温离心机、无水乙醇、可调式移液器和蒸馏水。
总抗坏血酸( TAA )含量测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本
称取约0 . 1g组织(水分充足的果实样本取约0.5g 组织或更多),加入1mL 预先预冷的提取液，进行冰浴匀浆，室温静提10min 后，12000rpm,4℃离 心 1 0min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取。比例进行提取。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30 min, 调节波长到534nm, 蒸馏水调零。
② 取 0 . 1mL上清液至新 EP 管中，加入0.05mL 试剂 a 混匀，接着加入0.4mL 试剂 b混匀，(此时整体液体为中性：PH 为7-8),室温(25℃)下反应10min, 之后再加0. 1mL试剂c 混匀(此时整体液体为酸性：PH 为1-2),此混合液为 TAA 待检液。
③ 依次在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 标准管 (仅做一次) | 空白管 (仅做一次) |
AA待检液 | 300 | | |
标准液 | | 300 | |
提取液 | | | 300 |
试剂一 | 150 | 150 | 150 |
无水乙醇 | 150 | 150 | 150 |
试剂二B液 | 75 | 75 | 75 |
试剂三 | 150 | 150 | 150 |
试剂四 | 75 | 75 | 75 |
混匀，于30℃反应60min后，立即取全部澄清液体(若有沉淀需8000rpm,室温离心5min,取上清液)至1mL玻璃比色皿中，立即于534nm处读取各管吸光值A。 |
注 :
1、若提取完的样本上清液有较强的背景色(如粉色，红色等),需增设一个样本自身对照：即对照管为300μL 样本+200μL 试剂—+200μL 无水乙醇+100μL 试剂二 B 液+300μL 无水乙醇，30℃反应60min 后，剩余步骤同测定管，△A=A 测定-A 对照。
2、若测定管大于1.8,可对样本进行稀释 D, 或降低样本量则试剂一相应增加。则稀释倍数 D 或改变后的样本体积 V1 需代入公式重新计算。
结果计算：
1、按样本质量计算：
TAA(mg/g鲜重)=[(A测定-A 空白)÷(A标准-A 空白)]×(C 标准×V 标准)÷(W×V1÷ V)×6.5×D=0.01×(A测定-A 空
白)÷(A 标准-A 空白)÷W×D
2、按液体体积计算：
TAA(mg/mL)=[(A测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白)]×(C 标准×V 标准)÷V1×6.5×D=0.01×(A测定-A 空白)÷(A准-A空白)×D
V---加入提取液体积，1 mL;V¹---TAA待检液体积，0.3mL;
V 标准---加入标准液体积，0.3mL;C标准---标准液浓度，0.01mg/mL;
W--- 样品质量 (g);D---稀释倍数，若没有稀释即为1。
