糖原磷酸化酶b(GPb)检测试剂盒 ; 100管/48样
测定意义：
糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase ，GP ，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开 α-1 ，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放 1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子 α-1 ，6-糖苷键分支点前 4 个葡萄糖基处。GP 分为有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa）和无活性的糖原磷酸化酶b（GPb）两种形式。 GPb 在一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）存在下可被激活。
测定原理：
GP 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP 还原生成 NADPH ，在 340nm 下测定 NADPH 上升速率，即可反映 GP 活性。添加一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）时测定 GP（GPa 和GPb）活性，未添加腺苷酸（5，-AMP）时测定 GPa活性，GP 活性－GPa 活性得到GPb 活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 16 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶， -20℃保存；
试剂三：粉剂×1支， -20℃保存；
试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；
试剂五：粉剂×1支， -20℃保存；
样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零；
2、工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
4、剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
5、试剂五的配制：临用前在试剂五管中加入 500μL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
6、将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于 37℃预热 5 分钟；
7、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三、10μL 试剂四、10μL 蒸馏水和 160μL 工作液，立即混匀，记录 340nm 处 5min 后的 A1 和 10min 后的吸光值 A2 ，计算 ΔAGPa=A2-A1。
8、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三、10μL 试剂四、10μL 试剂五和 160μL 工作液，立即混匀，记录 340nm处5min 后的A3和10min 后的吸光值 A4 ，计算 ΔAGP=A4-A3。
注 意：由于每个样本需要同时测一个GP（GPa 和GPb）活性和一个 GPa 活性，因此本试剂盒 100 管测 48个样本。
GPb活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：
每mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
GPb(nmol/min/mg prot)＝ [(ΔAGP - ΔAGPa)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP - ΔAGPa)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位定义：
每g组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
GPb(nmol/min/g鲜重)＝[(ΔAGP-ΔAGPa)×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=643×(ΔAGP- ΔAGPa)÷W
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε;NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径, 1cm;V 样：加入样
本体积,0.01 mL；V 样总：加入提取液体积,1 mL；T：反应时间,5 min；Cpr：样本蛋白质浓度,mg/mL；W：样本质量，g。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下：
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：
每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
GPb (nmol/min/mg prot)＝ [(ΔAGP- ΔAGPa)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1286×(ΔAGP - ΔAGPa)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算单位定义：
每 g 组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。GPb(nmol/min/g
鲜重)＝[(ΔAGP-ΔAGPa)×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V样总)÷T=1286×(ΔAGP- ΔAGPa)÷WV
反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光径, 0.5cm；V 样：加
入样本体积,0.01 mL；V 样总：加入提取液体积,1 mL；T：反应时间,5 min;Cpr：样本蛋白质浓度,mg/mL;W：样 本质量,g。
