丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)检测试剂盒 ; 100管/96样
测定意义：
丙酮酸磷酸双激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1 ）是 C4 途径和景天科酸代谢途径的限速酶，催化 ATP、丙酮酸和 Pi 经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸。该酶主要存在于 C4 植物的叶绿体基质中，对光合功能具有重要调节作用。
测定原理：
PPDK 的逆向反应催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP 和 PPi 生成丙酮酸、ATP 和 Pi ，乳酸脱氢酶进一步催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD+ ，在 340nm 测定 NADH 减少速率，计算 PPDK 活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 25 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；
试剂三 ：液体 40μL×1支， 4℃保存；体积较少，若沾在管壁上，临用前可低速离心后使用。
样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤和加样表：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
(1) 工作液的配制：临用前取试剂二一瓶加入 10mL 试剂一和 5μL 试剂三，充分混匀，置于 37℃水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
(2) 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 37℃反应 5min 后的吸光值 A2 ，计算 ΔA=A1-A2。
PPDK 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：
每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位
PPDK(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位定义：
每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。PPDK(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷
V 样总)÷T=643×ΔA÷WV 反总：反应体系总体积，2×10ˉ⁴ L；ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿
光径, 1cm;V 样:加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积,1 mL;T：反应时间,5 min;Cpr：样本蛋白质浓度, mg/mL;
W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：
每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PPDK(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位定义：
每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PPDK(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V 样总)÷ T=1286×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积，2×10ˉ⁴
Lε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光径， 0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入
提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
