焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP)检测试剂盒 ; 50管/48样
测定意义:
焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP ,EC2.7.1.90)是一种胞质酶,广泛存在于植物组织中,催化果糖-6-磷酸与果糖-1,6-二磷酸之间的可逆转化,在光合作用碳代谢中起重要作用。
测定原理:
PFP 催化 6-磷酸果糖转化为 1,6-二磷酸果糖,它在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作用下转变为 3-磷酸甘油醛,再由 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 催化生成 3-磷酸甘油酸、NAD 和磷酸,340nm 处的吸光度变化反映了 PFP的活性的高低。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿。
试剂组成和配制:
提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 30mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 5mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 5 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:液体 0.5mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂五:液体 0.5mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂六:液体 5mL×1 瓶,4℃避光保存。
酶液提取:
1、组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1 :5~10 的比例(建议称取约 0.1g ,加入 1mL 提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃, 10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。
2、细胞:按照细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)为 500~1000 :1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w ,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 4℃ , 10000g离心 10min,取上清置冰上待测。
3、液体:直接检测。
测定操作:
1、分光光度计预热 30min ,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、取 1mL 石英比色皿,依次加入 580μL 试剂一,100μL 试剂二,100μ L 试剂三,10μ L 试剂四,10μ L 试剂五,100μL 试剂六,100μ L 粗酶液,充分混匀,记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2
计算公式:
(1) 按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:
每毫克组织蛋白每分钟消1nmol的NADH 定义为一个酶活力单位。
PFP(nmol/min/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
酶活单位定义:
每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PFP(nmol/min /g鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W×V 样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
(3) 按照细胞数量计算
酶活单位定义:
每10⁴个细胞每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
PFP(nmol/min /10⁴cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
酶活单位定义:
每毫升液体每分钟消耗1nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
PFP(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔAV反总:反应体系总体积,1mL;ε :NADH 摩尔消光系
数,6.22×10³ L / mol /cm; d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应
时间,5 min ;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量,g