磷酸丙糖异构酶(TPI)检测试剂盒 ; 50管/48样
测定意义：
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与 calvin 循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。
测定原理：
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为 3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与 NAD 在 3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成 3-磷酸甘油酸和 NADH ，340nm 处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿。
试剂组成和配制：
提取液一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
提取液二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 5mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 5 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 5 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂
分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
粗酶液制备：
①总 TPI 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W ，破碎3s ，间歇 7s ，总时间 1min），然后 4℃ , 8000g 离心 10min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体 TPI 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5～10 的比例（建议称取约0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃ , 200g 离心 5min ，弃沉淀，取上清在 4℃ , 8000g 离心10min ，取上清用于测定胞浆 TPI 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W ，破碎 3s ，间歇 7s ，总时间 1min），然后 4℃ , 8000g 离心 10min ，取上清测定叶绿体中 TPI 酶活性。建议测定总 TPI 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 TPI ，则按照步骤②提取粗酶液。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min ，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、取 1mL 石英比色皿，依次加入 600μL 试剂一，100μ L 试剂二，100μ L 试剂三，100μ L 试剂四，100μ L 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2，△A=A2-A1。
Rubisco 活性计算：
(1) 按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:
每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min /mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
酶活单位定义：
每克组织每分钟生成 1nmol的NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min /g鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=321.54×ΔA÷WV 反总：反应体系总体积，1mL；ε ：
NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm ；V样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液
体积，1mL；T：反应时间，5 min ；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g。
