磷酸丙糖异构酶(TPI)检测试剂盒 ; 100T/96S
测定意义：
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与 calvin 循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。
测定原理：
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为 3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与 NAD 在 3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成 3-磷酸甘油酸和 NADH ，340nm 处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
需自备的仪器和用品：
天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。
试剂的组成和配制：
提取液一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
提取液二：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
酶液提取：
①总 TPI 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W ，破碎3s ，间歇 7s ，总时间 1min），然后 4℃ , 8000g 离心 10min，取上清测定。
②胞浆和叶绿体 TPI 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5～10 的比例（建议称取约0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃ , 200g 离心 5min ，弃沉淀，取上清在 4℃ , 8000g 离心10min ，取上清用于测定胞浆 TPI 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W ，破碎 3s ，间歇 7s ，总时间 1min），然后 4℃ , 8000g 离心 10min ，取上清测定叶绿体中 TPI 酶活性。
建议测定总 TPI 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 TPI ，则按照步骤②提取粗酶液。
测定操作：
1、分光光度计/酶标仪预热30min ，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 120μL 试剂一，20μ L 试剂二，20μ L 试剂三，20μ L 试剂四，20μL
3、粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2，△A=A2-A1。
计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：
每毫克组织蛋白每分钟生1nmol的NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
酶活单位定义：
每克组织每分钟生成1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min/g鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V样总)÷T=321.54× ΔA÷W
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm; V 样：加入样本
体积，0.02mL;V 样总：加入提取液体积,1mL；T：反应时间,5 min ;Cpr:样本蛋白质浓度，mg/mL;W:样本质量，g
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：
每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。TPI(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(
V样×Cpr)÷T= 643.08×ΔA÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
酶活单位定义：
每克组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min/g鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 643.08×ΔA÷WV 反总：反应体系总体积，0.2mL；
ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm;d：比色皿光径，0.5cm;V 样：加入样本体积，0.02mL;V 样总：加入提
取液体积，1mL；T：反应时间，5 min ；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
