辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒 ; 50管/24样
测定意义：
辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧， 在合成 ATP 的同时，形成大量的 ROS ，同时 NADH 再生为 NAD⁺ 。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD⁺比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD⁺比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外，NAD⁺降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理：
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH ，NADH 通过 PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm下检测吸光值；而 NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 4 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存，用时加入 4mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周；
试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃保存，用时加入 4mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周；
试剂五：液体 1.8mL×1 支，4 ℃保存；
试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；
试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。
NAD⁺和 NADH的提取：
1、血清(浆)中NAD+和 NADH的提取：
NAD⁺的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1 ：5~10的比例（建议取约 0.1mL血清（浆），加入 1mL 酸性提取液）,95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）;冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min; 取 500 μ L 上清液，加入 500 μ L 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NADH的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1 ：5~10 的比例（建议取约 0.1mL血清（浆），加入 1mL 碱性提取液）,95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）;冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min; 取 500 μ L 上清液，加入 500 μ L 酸性提取液使之中和, 混匀,10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织中 NAD+和 NADH的提取：
NAD⁺的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g 组织，加入1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取 500 μL上清液，加入 500 μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。
NADH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1 ：5~10 的比例（建议取约 0.1g 组织，加入1mL碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防
止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500 μ L上清液，加入 500 μ L酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取 上清，置冰上待测。
3、细胞或细菌中 NAD+和 NADH的提取：
NAD⁺的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min
（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4℃离心 10min；取 500 μ L 上清液，加入 500 μ L碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（ 10⁴个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000 ：1的比例（建议 500万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次），95℃水浴 5min
（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500 μ L上清液，加入500 μ L酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。
2、加样表(在 1.5mL棕色 EP管中按下表依次加样）：
试剂名称(μL) | 对照管 | 测定管 |
样本 | 50 | 50 |
试剂一 | 250 | 250 |
试剂二 | 75 | 75 |
试剂三 | 75 | 75 |
试剂四 | 75 | 75 |
试剂五 | 35 | 35 |
试剂六 | 500 | 混匀，室温避光静置 20min |
试剂六 | | 500 |
充分混匀，静置 5min 后，20000g ，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入： |
试剂七 | 1000 | 1000 |
混匀，570nm 下比色，读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。 |
注意事项：
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NAD⁺测定中△A（A2-A1） ≤0.0302 ，NADH 测定中△A（A2-A1） ≤0.0222，已低于检测限，可做如下调整：
(1)将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min ；
(2)在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 50管保证测24个NAD⁺或 NADH.。
NAD⁺和 NADH含量的计算：
一、NAD⁺含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.295x + 0.0302 ，R2 = 0.9978；其中 y 为△A ，x 为NAD⁺浓度 nmol/mL
1、血清(浆)中 NAD+含量计算
NAD⁺含量(nmol/mL)=[(△A -0.0302)÷0.295×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=67.8×(△A -0.0302）
2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算(1)按样本蛋白浓度计算
NAD⁺(nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(V1×Cpr)= 3.4×(△A -0.0302）÷Cpr
(1) 按样本鲜重计算
NAD⁺(nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(W×V1÷V2)= 6.8×(△A -0.0302）÷W
(2) 按细菌或细胞密度计算
NAD⁺(nmol/104 cell)=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.014×(△ A -0.0302）
二、NADH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.2808x + 0.0222 ，R2 = 0.9976；其中 y 为△A ，x为 NADH 浓度 nmol/mL
1、 血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 71.2×(△A -0.0222）
2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V1×Cpr)= 3.6×( △A -0.0222）÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 7.1×( △A -0.0222）÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/10⁴ cell）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.014×(△A -0.0222）
V1 ：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2 ：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清(浆) 体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质
浓度，mg/mL; W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数,500 万。
注 意：
最低检测限为 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot
