辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒 ; 100管/48样

辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒 ; 100管/48样

测定意义： 

辅酶 ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+ 是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成 ATP 的同时，形成大量的 ROS ，同时 NADH 再生为 NAD⁺。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD⁺比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的NAD(H)及 NADH/NAD⁺比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD⁺ 比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外，NAD⁺ 降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理： 

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH ，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为 NADH ，进一步采用 MTT 还原法检测。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 3 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶， -20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1瓶， 4 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂五：液体 3.6mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

NAD⁺和 NADH的提取：

1、血清(浆)中NAD⁺和 NADH的提取：

NAD⁺的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1 ：5~10 的比例（建议取约0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1 ：5~10 的比例（建议取约 0.1mL血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min ，取上清，

置冰上待测。

2、组织中 NAD⁺和 NADH的提取：

NAD⁺的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建

议取约 0.1g 组织，加入 1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧， 以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取 500μL 上清液，加入 500

μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4  ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。NADH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g 组织，加入 1mL碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧， 以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4  ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、细胞或细菌中 NAD⁺和 NADH的提取：

NAD⁺先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声 3s ，间隔 10s ，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后， 10000g 4 ℃离心 10min ；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀， 10000g 4  ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

（NADH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超声 3s ，间隔 10s ，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min ；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀， 10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。

2、加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样）：

注意事项：

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若 NAD⁺测定中△A（A2-A1） ≤0.0302 ，NADH 测定中△A（A2-A1） ≤0.0222 ，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：

(1)将测定管避光静置时间 20min 延长到60min；

(2)在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个 NAD⁺或 NADH。NAD⁺和 NADH含量的计算：

一、NAD⁺含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.1475x + 0.0302 ，R2 = 0.9978 ；其中 y 为△A ，x 为 NAD⁺浓度 nmol/mL

1、血清（浆）中 NAD⁺含量计算

     NAD⁺含量(nmol/mL）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302）

2、组织、细菌或细胞中 NAD⁺含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

      NAD⁺(nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302）÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

      NAD⁺ (nmol/g  鲜重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302）÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

      NAD⁺(nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）

二、NADH 含量的计算

      标准条件下的回归曲线为 y = 0.1404x + 0.0222 ，R2 = 0.9976；其中 y 为△A ，x 为 NADH 浓度 nmol/mL

1、血清（浆）中 NADH 含量计算

      NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）

2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

      NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222）÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

      NADH (nmol/g鲜重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222）÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

      NADH (nmol/10⁴cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028 ×(△A-0.0222) 。

      V1 ：加入反应体系中样本体积，0.02mL ；V2 ：加入提取液体积，2mL ;V3: 加入血清(浆)体积： 0.1mL；Cpr：样本蛋白质

      浓度，mg/mL; W：样本质量, g；500：细胞或细菌总数，500 万

注 意：

最低检测限为 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot 。