铁离子还原能力检测试剂盒/96样
测定意义：
抗氧化物可以还原 Fe3+- 三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的 Fe2+-TPTZ, 随后在 590nm 测定蓝色的 Fe2+-TPTZ 即可获得样品中的铁离子还原能力，吸光值越高表示样品的还原能力越强。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体1.5mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体1.5mL×1支 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、恒温水浴锅、低温离心机、可调式移液器、研钵、蒸馏水。
铁离子还原能力测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取0.1g 样本(若是干样可取0.02-0.05g),加入1mL 的80%乙醇(自备)进行匀 浆，匀浆后转入2mL 离心管中；于60℃,200-300W 条件下超声提取30min(间隔 5min 振荡混匀一次)。12000rpm, 离心1 0min, 取上清，置冰上待测。
② 液体样本：水溶性样本可直接检测。若是油性样本，可用80%乙醇溶解后再取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min, 调节波长至590nm。
② 显色液配置：将试剂一、试剂二、试剂三按10:1:1 的比例混合，使用前37℃预温， 现配现用，注意避光。
③ 不同样本抗氧化能力不一，可先选取2个样本做检测，若 A 测定超过1.5,需对样 本用80%乙醇稀释，稀释倍数 D 代入公式计算。
④ 在96孔板中依次加入：
试剂(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 5 | 0 |
蒸馏水 | 25 | 30 |
显色液 | 170 | 170 |
混匀后 , 室温2 5℃ , 准确反应1 0 m i n , 于5 9 0 n m 处 读 取 吸光 值 A ; △ A = A 测 定 - A 空 白 ； |
注 :
1、若 A 测定值超过1.5,可对样本用提取液进行稀释，或减少样本上样量 V1 ( 如减至2μL, 则提取液增至28μL), 则稀释倍数D或加样量 V1需代入公式重新计算。
2、若△A 的值在零附近，可增加样本量 V1 (如增至15μL, 则蒸馏水相应减少),则改变后的 V1 需代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线：
y=0.3209x-0.0165,x 是标准品(FeSO4) 摩尔浓度(μmol/mL),y 是△A。
2、组织样本：
(1) 按样本质量计算：
铁离子还原能力(μmol FeSO4/g 重量)=[(△A+0.0165)÷0.3209×V1]÷(V1÷V×W)×D=3.12×(△A+0.0165)÷W×D
(2) 按样本蛋白浓度计算：
铁离子还原能力(μmolFeSO4/mgprot)=[(△A+0.0165)÷0.3209×V1]÷(V1×Cpr)×3.12×(△A+0.0165)÷Cpr×D
3、液体样本：
铁离子还原能力(μmolFeSO4/mL)=[(△A+0.0165)÷0.3209×V1]÷V1×D=3.12×(△A+0.0165)×DV---加入提取液体积，1 mL;V1--- 反应中样品 体积，5μL=0.005mL;W--- 样品质量,g;D--- 稀释倍数,未稀释即为1;Cpr--- 样本蛋白浓度,mg/mL,建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
注 意:
1、由于本方法是显蓝色测定吸光值，因此尽量避免使用在酸性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂，否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。
2、样本中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢剂和 DTT、 巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。
3、如果样品测定出来的吸光值在标准曲线范围以外，需把样品适当稀释或浓缩后再进行测定。
4、如果样本中处理过程中施加了较高浓度的铁盐或亚铁盐，会干扰测定，不宜使用本测试方法。
附 ：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(100μmol/mL): 临用前加1mL蒸馏水，充分溶解混匀。
2、把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.8,1.6,2.4,3.2,4μmol/mL。 也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按照测定管加样体系操作，依据结果即可制作标准曲线。
