乙二醛酶Ⅱ(Gly II)活性检测试剂盒/24样
测定意义：
乙二醛酶系统是甲基乙二醛 (MG) 的主要清除途径，乙二醛酶Ⅱ(GlyⅡ,EC3.1.2.6)是乙二醛酶系统中的一种酶。在哺乳动物，植物和细菌中普遍表达。
乙二醛酶Ⅱ催化 S-D-乳酰谷胱甘肽(S-D-lactoylglutathione,SLG)水解为还原型谷胱甘肽 (GSH) 和 D-乳酸。还原型谷胱甘肽 (GSH) 与 DTNB 与反应生成黄色复合物，该有色物质在412nm 处有特征吸收峰通过检测412nm 处上升速率，进而得出乙二醛酶Ⅱ(GlyⅡ) 酶活性的大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体0.5mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂三 | 粉体mg×支 | -20℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加0.55mL蒸馏水完全溶解备用，溶好的试剂可-20度分装保存，禁止反复冻溶。 |
标准品 | 粉体mg×支 | -20℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、可调式移液器、低温离心机、研钵、 蒸馏水。
乙二醛酶Ⅱ(GIyⅡ)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本称取0 . 1g 组织样本(水分充足可取0.2g), 先 加 入 1mL 的提取液，冰浴匀浆， 12000rpm,4℃离心10min, 上清液待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热，调节波长至412nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂预热至室温(25℃),在1mL 玻璃比色皿(光径1cm) 中依次加入下列试
剂(依据样本检测数量，试剂一和二可按照比例570:20提前混合，直接加590 μL 即可):
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 100 |
试剂一 | 570 |
试剂二 | 20 |
试剂三 | 20 |
混匀，室温(25℃)下，30s后立即于412nm处读取吸光值A1,3min后再读取A2。△A=A2-A1。 |
注 :
1、若△A 值在零附近徘徊，可增加样本加样体积 V1 (如增至200μL, 则试剂一相应减少),或增加反应时间 T (如增至10min 后读取 A2), 或增加样本取样质量 W。 则 改变后的 V1 和 T 和 W 需代入公式计算。
2、若△A 值大于0.8或者 A1 值大于1.2,则需减少样本加样体积 V1 (如减至50μL,则试剂一相应增加),或减少反应时间 T (如减至1min 后读取 A2)。则改变后的 V1 和 T 需代入公式计算。
结果计算：
1、标准曲线为：
y =0.0199x-0.0105;x 为标准品摩尔质量(nmol),y为△A。
2、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol的 GSH定义为一个酶活力单位。
GlyⅡ(nmol/min/mg prot)=[(△A+0.0105)÷0.0199]÷(V1×Cpr)÷T=167.5×(△A+0.0105)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每克组织样本每分钟生成1nmol 的 GSH 定义为一个酶活力单位。
GlyⅡ(nmol/min/g 鲜重)=[(△A+0.0105)÷0.0199]÷(W×V1÷V)÷T=167.5×(△A+0.0105)÷W
V1---加入样本积，0.1mL;V--- 加入提取液体积，1mL;W--- 样本质量，g;T---反应3min;Cpr--- 蛋白质浓度，mg/mL, 建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(10μmol/mL): 标准品溶于1mL蒸馏水中，(母液需在两天内用且-20℃保存)。
2、把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5. μmol/mL。 也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依次在 EP 管中加入100 μL 标准品+590 μL 试剂—+20 μL 试剂二，混匀后静置5min 后全部液体转移至1mL 玻璃比色皿(光径1cm) 中，于412nm 读值，根据结果即可制 作标准曲线。
