乙二醛酶Ⅱ(Gly II)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
乙二醛酶系统是甲基乙二醛（ MG）的主要清除途径 ，乙二醛酶Ⅱ（GlyⅡ , EC 3.1.2.6）是乙二醛酶系统中的一种酶。在哺乳动物，植物和细菌中普遍表达。
乙二醛酶Ⅱ催化 S-D-乳酰谷胱甘肽(S-D-lactoylglutathione, SLG)水解为还原型谷胱甘肽（GSH）和 D-乳酸。还原型谷胱甘肽（ GSH）与 DTNB 与反应生成黄色复合物，该有色物 质在 412nm 处有特征吸收峰；通过检测 412nm 处上升速率，进而得出乙二醛酶Ⅱ（GlyⅡ)酶活性的大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 提取液 110mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体 13mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体 1mL×1 支 | 4℃保存 | |
试剂三 | 粉体 mg×2 支 | -20℃保存 | 每支用前甩几下使试剂落入底部，分别加0.55mL蒸馏水完全溶解备用，溶好的试剂可-20℃分装保存，禁止反复冻溶。 |
标准品 | 粉体mg×支 | -20℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
乙二醛酶Ⅱ(GIyⅡ)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取 0.1g 组织样本（水分充足可取 0.2g），先加入 1mL 的提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，上清液待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1 ：5~10 的比例提取
2、上机检测：
① 酶标仪预热，调节波长至 412nm。
② 所有试剂预热至室温（25℃),在 96 孔板中依次加入下列试剂（依据样本检测数量，试剂一和二可按照比例130:10 提前混合，直接加140μL即可）：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 50 |
试剂一 | 130 |
试剂二 | 10 |
试剂三 | 10 |
混 匀 ，室 温（2 5 ℃ ) 下，1 m i n后立即 于 4 1 2 n m 处 读 取 吸 光 值A 1，3 m i n后 再 读 取A 2 。 Δ A = A 2 - A 1 。 |
注 :
1、若ΔA 值在零附近徘徊，可增加样本加样体积 V1（如增至100 μL，则试剂一相应减少） ，或增加反应时间 T（如增至 10min 后读取 A2)，或增加样本取样质量 W。则改变后的 V1 和 T 和 W 需代入公式计算。
2、若ΔA 值大于 0.8 或者 A1 值大于 1，则需减少样本加样体积 V1（如减至 20 μL，则试剂一相应增加），或减少反应时间 T（如减至1min 后读取 A2）。则改变后的 V1 和 T需代入公式计算。
结果计算：
1、标准曲线：
y = 0.0447x + 0.0017 ；x 为标准品摩尔质量（nmol），y为ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每分钟生成 1nmol 的 GSH 定义为一个酶活力单位。
Gly Ⅱ (nmol/min/mg prot)=[( Δ A-0.0017) ÷ 0.0447] ÷ (V1 × Cpr) ÷ T=149.14 × ( Δ A- 0.0017) ÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每克组织样本每分钟生成 1nmol 的 GSH 定义为一个酶活力单位。
GlyⅡ(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0017)÷0.0447] ÷ (W ×V1÷V) ÷T=149.14 × (ΔA- 0.0017)÷W
V1---加入样本体积，0.05mL； V---加入提取液体积， 1mL；W---样本质量， g；T---反应时间，3min；Cpr---蛋白质浓度，mg/mL，建议使 用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（10μmol/mL）：标准品溶于 1mL 蒸馏水中，（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2、把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依次在 96 孔板中加入 50 μL 标准品+140μL 试剂一+10μL 试剂二，混匀后静置 5min后于 412nm 读值，根据结果即可制作标准曲线。
