总抗坏血酸(TAA)含量测定(红菲咯啉法)活性检测试剂盒/96样
测定意义：
总抗坏血酸(TAA) 包括还原型和脱氢型抗坏血酸，其中脱氢抗坏血酸被还原为还原型抗坏 血酸，接着还原型抗坏血酸把三价铁离子还原成二价铁离子，二价铁离子与红菲咯啉反应生 成红色络和物，在534nm 处有特征吸收峰，颜色深浅与还原型抗坏血酸含量成正比，继而计算得出总抗坏血酸的含量。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂a | 液体5mL×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部，再加入15ml的25%硫酸，混匀，4℃保存。 |
试剂b | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂c | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 |
A:液体×1支
试剂瓶B(空瓶)
| 4℃保存 | 试剂二B液配制：临用前取出0.047mLA液至试剂瓶B中，再加9.953mL无水乙醇，混匀备用。 |
试剂三 | 粉体 m g ×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下使粉体落入底部，再加13mL无水乙醇混匀溶解(该试剂难溶，可超声溶解)。 |
试剂四 | 液体5mL×1瓶 | 4℃保存 | 溶液为淡黄色。 |
标准品 | 粉剂×2支 | 4℃保存 | 临用前：每支用前甩几下标准品管粉剂 落入底部，再加入1mL试剂一混匀溶解，即得1mg/mL,再用试剂一稀释100倍为0.01mg/mL溶液即为标准液(现配现用)。落入底部，再加入1mL试剂一混匀溶 解，即得1mg/mL,再用试剂一稀释100倍为0.01mg/mL溶液即为标准液(现配现用) |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、研钵、冰、低温离心机、无水乙醇、可调式移液器和蒸馏水。
总抗坏血酸( TAA )含量测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0. 1g 组织(水分充足的果实样本取约0.5g 组织或更多),加入1mL 预先预冷的提取液，进行冰浴匀浆，室温静提10min 后，12000rpm,4℃ 离 心 1 0min, 取上清，置冰上待检。
注: 若增加样本，可按照组织质量(g): 试剂一体积(mL)为1:5~10的比例进行提取
② 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30 min, 调节波长到534nm。
② 取0 . 1mL上清液至新EP 管中，加入0.05mL试剂 a 混匀，接着加入0.4mL试剂 b混匀，(此时整体液体为中性：PH 为7-8),室温(25℃)下反应10min, 之后再加0. 1mL试剂c 混匀(此时整体液体为酸性：PH 为1-2),此混合液为 TAA 待检液。
③ 依次在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 标准管 (仅做一次) | 空白管 (仅做一次) |
AA待检液 | 200 | | |
标准液 | | 200 | |
提取液 | | | 200 |
试剂一 | 100 | 100 | 100 |
无水乙醇 | 100 | 100 | 100 |
试剂二B液 | 50 | 50 | 50 |
试剂三 | 100 | 100 | 100 |
试剂四 | 50 | 50 | 50 |
混匀，于30℃反应60min后，立即取出200μL澄清液体(若有沉淀需8000rpm,室温离心5min,取上清液)至96孔板中，立即于534nm处读取各管吸光值A。 |
注 :
1、若提取完的样本上清液有较强的背景色(如粉色，红色等),需增设一个样本自身对照：即对照管为200 μL 样本+100 μL 试剂—+100μL 无水乙醇+50μL 试剂二 B 液 +150μL 无水乙醇，30℃反应60min 后，剩余步骤同测定管，△A=A 测定-A 对照。
2、若测定管大于1.5,可对样本用试剂一进行稀释 D, 或降低样本量则试剂一相应增加。则 稀释倍数 D 或改变后的样本体积 V1 需代入公式重新计算。
结果计算：
1、按样本质量计算：
TAA(mg/g 鲜重)=[(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白)]×(C 标准×V 标准)÷(W×V1÷V)×6.5×D=0.01×6.5×(A测定-A空白)÷(A标准-A空 白)÷W×D
2、按液体体积计算：
TAA(mg/mL)=[(A测定-A空白)÷(A标准-A 空白)]×(C 标准×V 标准)÷V1×6.5×D=0.01×6.5×(A 测定-A空白)÷(A 标准-A空白)×D
V---加入提取液体积，1 mL;V1---TAA待检液体积，0.2mL;V 标准---加入标准液体积，0.2mL;C标准---标准液浓度，0.01mg/mL;W--- 样品质 量 (g);6.5--- 样本上清液的稀释倍数；D--- 稀释倍数，若没有稀释即为1。
