总抗坏血酸(TAA)含量测定(2,4-二硝基苯肼法)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
总抗坏血酸 (TAA) 包括还原型和脱氢型抗坏血酸，其中还原型抗坏血酸易被氧化为脱氢型抗坏血酸，后者与2,4-二硝基苯肼作用生成可溶于硫酸的红色，该红色物质在520nm下有大吸收峰，进而计算得到总总抗坏血酸 (TAA) 含量。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部，再加入25ml的25%硫酸，混匀，4℃保存。 |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、 浓硫酸、研钵冰、低温离心机、可调式移液器。
总抗坏血酸( TAA )含量测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0.3g 组织(水分充足的样本取约0.5g 组织),加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃ 离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取。
② 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30 min, 调节波长到520 nm, 蒸馏水调零。
② 依次在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 80 | 80 |
试剂一 | 240 | |
38℃(恒温培养箱或水浴锅),孵育3小时。 |
试剂一 | | 240 |
85%硫酸(务必在冰上缓慢加入) | 560 | 560 |
混匀，室温25℃静置20min(准确时间)。液体全部转移至1mL玻璃比色皿中，于520nm处分别读取A值，△A=A测定-A对照(每个测定管需 要一个对照管)。 |
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.0258x+0.0066,x是标准品 VC 质量(μg),y是△A。
2、按蛋白浓度计算：
TAA(μg/mg prot)=[(△A-0.0066)÷0.02581-(Cpr×V1)×D=484.5×(△A-0.0066)÷Cpr×D
3、按样本质量计算：
TAA(μg/g鲜重)=[(△A-0.0066)÷0.0258]÷(W×V1÷V)×D=484.5×(△A-0.0066)÷W×D
4、按液体体积计算：
TAA(μg/mL)=[(△A-0.0066)÷0.0258]÷V1×D=484.5×(△A-0.0066)×D V----加入提取液体积，1 mL;V1----加入反应体系中上清液体积， 0.02mL;W---- 样品质量 (g);D---- 稀释倍数，若没有稀释即为1;Cpr-----上清液蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(0.5mg/mL): 向标准品中加入2mL 蒸馏水，充分溶解，(母液需在两天内用且-20℃保存)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5.mg/mL 。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据测定管1的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
