总抗坏血酸(TAA)含量测定(2,4-二硝基苯肼法)活性检测试剂盒/96样
测定意义：
总抗坏血酸（TAA）包括还原型和脱氢型抗坏血酸,其中还原型抗坏血酸易被氧化为脱氢型抗坏血酸，后者与 2，4－二硝基苯肼作用生成可溶于硫酸的红色脎，该红色物质在 520nm下有吸收峰，进而计算得到总抗坏血酸（TAA）含量。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体110mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部，再加入 15ml 的 25%硫酸，混匀，4℃保存。 |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、浓硫酸、研钵冰、低温离心机、可调式移液器和蒸馏水 。
总抗坏血酸( TAA )含量测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.3g 组织(水分充足的样本取约 0.5g 组织)，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm, 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1 ：5~10 的比例进行提取
② 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30 min，调节波长到520 nm。
② 依次在 96 孔板中或 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 20 | 20 |
试剂一 | 60 | |
38 ℃（恒温培养箱，若用96孔板，则需用板子或保鲜膜遮盖，防止水分蒸发），孵育3小时8℃(恒温培养箱或水浴锅),孵育3小时。 |
试剂一 | | 60 |
85%硫酸(务必在冰上缓慢加入) | 140 | 140 |
混匀，室温2 5℃静置20min(准确时间)。 液体全部转移96孔板中，于520nm处分别读取A值，ΔA=A测定- A对照(每个测定管需要一个对照管 ） |
结果计算：
1、标准曲线方程：
y = 0.0611x + 0.0003，x 是标准品VC质量(μg），y是ΔA。
2、按蛋白浓度计算
TAA(μg/mg prot) =[(△A-0.0003)÷0.0611] ÷ (Cpr ×V1) × D=818 × (△A-0.0003) ÷Cpr × D
3、按样本质量计算
TAA ( μg /g 鲜重) =[(△A-0.0003) ÷0.0611] ÷ (W ×V1÷V) × D = 818 × (△A-0.0003) ÷W ×D
4、按液体体积计算
TAA(mg/mL)=[(A测定-A空白)÷(A标准-A空白)]×(C标准×V标准)÷V1×6.5×D=0.01×6.5×(A测定-A空白)÷(A标准-A 空白)×DV---加入提取 液体积，1 mL;V1---TAA待检液体积，0.2mL;V 标准---加入标准液体积，0.2mL;C标 准---标准液浓度，0.01mg/mL;W--- 样品质量 (g);6.5--- 样本上清液的稀释倍数；D--- 稀释倍数，若没有稀释即为1。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（1mg/mL）：向标准品中加入1mL 蒸馏水，充分溶解，（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
