土壤天冬酰胺酶(S-ASNase)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
天冬酰胺酶 (ASNase,EC 3.5.1.1) 是酰胺酶的一种，催化天冬酰胺水解成天冬氨酸 和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用。
土壤中的天冬酰胺酶 (S-ASNase)催化天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，利用氨在强碱的环境下与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝,溶液颜色稳定。其在630nm 处有特征吸收峰,通过检测氨增加的速率,即可计算该酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×2瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，每瓶再加6mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂三 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体24mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂六 | A:液体7mL×4瓶
B:液体μL×1支 | 4℃保存 | 临用前取60μL的B液进一瓶A液中，混匀后作为试剂六使用。混匀后的试剂六一周内用完。 |
标准品 | 液体mL×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、 台式离心机、可调式移液枪、水浴锅 或恒温培养箱、甲苯和蒸馏水。
土壤天冬酰胺酶(S-ASNase)活性测定：
取新鲜土样风干或者37℃烘箱风干，先粗研磨，过40目筛网备用。
注: 土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻。
2、上机检测：
① 培养：取EP管依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
土样(g) | 0.1 | 0.1 |
甲苯 | 20 | 20 |
振荡混匀，室温放置15min。 |
试剂一 | 200 | 200 |
试剂二 | 100 | 560 |
混匀，放入37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育2h。 |
试剂三 | 300 | 300 |
试剂二 | | 100 |
② 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至630nm, 蒸馏水调零。
③ 显色反应：在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
上清液 | 60 | 60 |
蒸馏水 | 180 | 180 |
试剂四 | 240 | 240 |
试剂五 | 120 | 120 |
试剂六 | 240 | 240 |
充分混匀，37℃放置20min后，全部液体转移至1mL玻璃比色皿(光径1cm)中，于630nm处读取吸光值A,△A=A测定管-A对照管(每个样本做一个自身对照)。 |
注:
1、试剂四和五和六需分开加，不能事先混匀。
2、若△A 的值较小，可以增加37℃孵育时间 T (如增至4小时或更长),或在显色反应
阶段增加上清液的量 V1(如增至120μL,则蒸馏水体积相应减少);则改变后的反应时间 T 和上清液体积V1 需代入计算公式重新计算。
3、若A测定的值大于1.8,可以减少37℃孵育时间 T (如减至1 小时或更短),或在 显色反应阶段减少上清液的量 V1(如减至30μL,则蒸馏水体积相应增加);则改变后的反 应时间 T 和上清液体积 V1 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=1.2921x-0.0071;x为标准品质量(μg),y为吸光值△A。
2、单位定义：
每克土样每小时催化天冬酰胺生成1 μg 氨定义为一个酶活力单位。
S-ASNase(μg/h/g 土样)=(△A+0.0071)÷1.2921×(V÷V1)÷W÷T=4×(△A+0.0071)÷W
V---反应体系总体积，0.62mL;V1--- 显色反应阶段上清液体积，0.06mL;T--- 反应时间，2h;W--- 土样质量；
附：标准曲线制作过程：
1、标准品母液(10μg/mL的氨 ) 。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,2,4,6,8,10 μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
