土壤天冬酰胺酶(S-ASNase)活性检测试剂盒/96样
测定意义：
天冬酰胺酶（ASNase， EC 3.5.1.1）是酰胺酶的一种，催化天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用。
土壤中的天冬酰胺酶（ S-ASNase）催化天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，利用氨在强碱的环境下与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液颜色稳定。其在 630nm 处有特征吸收峰，通过检测氨增加的速率，即可计算该酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×2瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，每瓶再加11mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂三 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体6mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂六 | A：液体3.5mL×4瓶 B ：液体μL×1支 | 4℃保存 | 临用前取 30μL 的 B 液进一瓶 A 液中，混匀后作为试剂六使用。混匀后的试剂六一周内用完。 |
标准品 | 液体mL×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该标曲。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、 96 孔板、台式离心机、可调式移液枪、水浴锅或恒温培养箱、甲苯和蒸馏水。
土壤天冬酰胺酶(S-ASNase)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取新鲜土样风干或者 37℃烘箱风干，先粗研磨，过40目筛网，备用。
注：土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻
2、上机检测：
① 培养：取EP管依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
土样(g) | 0.1 | 0.1 |
甲苯 | 20 | 20 |
振荡混匀，室温放置15min。 |
试剂一 | 200 | 200 |
试剂二 | 100 | |
混匀，放入37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育2h。 |
试剂三 | 300 | 300 |
试剂二 | | 100 |
充分混匀，沸水浴（95℃-100℃)0min，室温12000rpm离心10min，上清液待测。 |
② 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 630nm。
③ 显色反应：在 96 孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
上清液 | 15 | 15 |
蒸馏水 | 45 | 45 |
试剂四 | 60 | 60 |
试剂五 | 30 | 30 |
试剂六 | 60 | 60 |
充分混匀，37℃放置20min 后，于630nm 处读取吸光值A，ΔA=A测定管-A 对照管（每个样本做一个自身对照）。 |
注：
1、试剂四和五和六需分开加，不能事先混匀。
2、若ΔA 的值较小，可以增加 37℃孵育时间 T（如增至 4 小时或更长），或在显色反应阶段增加上清液的量 V1(如增至 30 μL，则蒸馏水体积相应减少)；则改变后的反应时间 T和上清液体积 V1 需代入计算公式重新计算。
3、若A测定的值大于1.5，可以减少37℃孵育时间 T（如减至1 小时或更短） ，或在显色反应阶段减少上清液的量 V1(如减至5μL，则蒸馏水体积相应增加)；则改变后的反应时间 T 和上清液体积 V1 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线：
y = 3.1715x - 0.0164 ；x 为标准品质量(μg），y为吸光值ΔA。
2、单位定义：
每克土样每小时催化天冬酰胺生成1μg 氨定义为一个酶活力单位。
D---S-ASNase ( μg/h/g 土样)=(ΔA+0.0164) ÷3.1715 × (V ÷V1) ÷W÷T
E---6.52 × (ΔA+0.0164)÷WF---V---反应体系总体积，0.62mL；V1---显色反应阶段上清液体积，0.015mL；G---T---反应时间，2h； W---土样质量；
附：标准曲线制作过程：
1、标准品母液（20μg/mL的氨）：
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 4, 8, 12, 16, 20μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
