土壤α-木糖苷酶试剂盒/48样
测定意义：
α-木糖苷酶(EC3.2.1.177)是一类木聚糖降解水解酶，存在于微生物等生物体，促使非还原 末端α-D- 木糖残基的水解，释放出α-D- 木糖。
土壤中α-木糖苷酶催化对硝基苯酚-α-D- 木糖苷产生对硝基苯酚(PNP), 该产物在405nm处有特征吸收峰，通过测定405nm 光吸收增加速率，即可计算土壤α-木糖苷酶活性。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部， 再加1.4mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂二 | 液体6mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液22mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、 96 孔板、台式离心机、可调式移液枪、水浴锅或恒温培养箱、甲苯和蒸馏水。
土壤a-木糖苷酶活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取新鲜土样风干或者 37℃烘箱风干，先粗研磨，过40目筛网，备用。
注：土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻
2、上机检测：
① 酶标仪预热30 min 以上，调节波长至405 nm。
② 在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
土样(g) | 0.1 | 0.1 |
试剂 — (μL) | 25 | |
蒸馏水 | | 25 |
试剂二(μL) | 55 | 55 |
混匀，45℃振荡反应30min |
试剂三(μL) | 220 | 220 |
混匀，12000rpm,离心10min,取上清液200μL于96孔板中，405n m 下读取吸光值A,△A=A测定 - A对照(每个样本需做 一 个自身对照)。 |
注:
1、若△A 过小，可以增加土样量或延长保温时间(如：60min 或更长),重新调整的 样本量 W 和反应时间 T 需代入计算公式重新计算。
2、若 A 测定超过1.5,可以减少土样量或降低保温时间(如：10min), 重新调整的样本量 W 和反应时间 T 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.2647x-0.0058;x 为标准品质量(μg),y 为吸光值△A。
2、单位定义：
每小时每克土样中产生1μg 对-硝基苯酚(PNP) 定义为一个酶活力单位。
土壤α-木糖苷酶活性(μg/h/g 土样)=(△A+0.0058)÷0.2647÷W÷T=7.56×(△A+0.0058)÷WT--- 反应时间，30min=0.5h;W--- 实际称取干土质量，g;PNP相对分子质量---139.11。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(1mg/mL): 向标准品EP管里面加入1ml 蒸馏水。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、在 EP 管加入：20μL标准品+5 μL 蒸馏水+55μL 试剂二+220 μL试剂三，混匀，取200μL 至 9 6 孔板中，于405nm下读取吸光值。
4、根据结果制作标准曲线。
