土壤核酸酶活性检测试剂盒/24样
测定意义：
核酸是土壤有机磷的组分之一，在核酸酶的作用下，核酸经过多步分解终释放出无机磷，水解产物是植物的磷源之一。土壤核酸酶的活性通过度量土壤核苷酸酶的活性测得。土壤核酸 酶即土壤核苷酸酶通过水解底物核糖核苷酸生成无机磷和其他物质，无机磷在酸性环境中与 钼酸铵反应生成蓝色复合物，通过在700nm 处检测该有色物质的生成速率即可计算土壤核酸酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体35mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加入30mL试剂一，充分溶解备用。 |
试剂三 | 液体25mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加入5mL蒸馏水，充分溶解备用。 |
试剂六 | 粉剂mg×3支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，每支再加入1.5mL蒸馏水,现配现用。 |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、天平、低温离心机、恒温水浴锅，可调式移液器。
土壤核酸酶活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取新鲜土样风干或者30℃烘箱风干，先粗研磨，过40目筛，备用。
注: 土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至700nm, 蒸馏水调零。
② 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
土壤样本(g) | 0.1 | 0.1 |
试剂二 | 500 | |
混匀，37℃振荡培养2h(间隔30min振荡混匀一次)。 |
试剂三 | 500 | 500 |
试剂二 | | 500 |
立即混匀，于12000rpm,室温或4℃离心10min。 |
③显色反应，在 EP 管中依次加入：
上清液 | 160 | 160 |
试剂四 | 400 | 400 |
试剂五 | 80 | 80 |
试剂六 | 80 | 80 |
混匀，室温静置10min,全部液体转移至1mL玻璃比色皿(光径1cm)中，于700nm处读取吸光值A,△A=A测定-A对照(每个样本需做一个自身对照)。 |
注 : 若△A 值在零附近徘徊，可在37℃孵育阶段延长反应时间 T(如增至3h 或更长), 或增加土壤样本量 W (如增至0.2g), 则改变后的反应时间T和W需代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.1283x+0.001;x是标准品 PNP 质量(μg),y是△A。
2、酶活定义：
37℃条件下，每克土样每小时释放出1μmol 的无机磷为一个酶活力单位。
土壤核酸酶活性(μmol/h/g 土样)=(△A+0.0016)÷1.0031×V1÷W÷T =0.5×(△A+0.0016)÷WV1---孵育阶段的反应总体积，1mL;T---- 反应时间，2h;W--- 样本质量，g;
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5μmoL/mL): 标准品用10mL蒸馏水溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液用试剂一稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1. μmoL/mL。 也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
