土壤核酸酶活性检测试剂盒/48样
测定意义：
核酸是土壤有机磷的组分之一，在核酸酶的作用下，核酸经过多步分解终释放出无机磷，水解产物是植物的磷源之一。土壤核酸酶的活性通过度量土壤核苷酸酶的活性测得。土壤核酸酶即土壤核苷酸酶通过水解底物核糖核苷酸生成无机磷和其他物质，无机磷在酸性环境中与钼酸铵反应生成蓝色复合物，通过在700nm 处检测该有色物质的生成速率即可计算土壤核酸酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加入55mL试剂一，充分溶解备用， |
试剂三 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 粉剂mg×2支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，每支加入1.5mL蒸馏水，充分溶解备用。 |
试剂六 | 粉剂mg×5支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，每支加入0.5mL蒸馏水溶解，现配现用。 |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
注: 全程操作需无磷环境；试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、天平、低温离心机、恒温水浴锅，可调式移液器。
土壤核酸酶活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取新鲜土样风干或者30℃烘箱风干，先粗研磨，过40 目筛备用。
注: 土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻；
2、上机检测：
① 酶标仪预热30 min 以上，调节波长至700 nm。
② 在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
土壤样本(g) | 0.1 | 0.1 |
试剂二 | 500 | |
混匀，37℃振荡培养2h(间隔30min振荡混匀一次)。 |
试剂三 | 500 | 500 |
试剂二 | | 500 |
立即混匀，于12000rpm,室温或4℃离心10min,上清液需立即测定，不可久置。 |
③显色反应，在96孔板中依次加入：
上清液 | 40 | 160 |
试剂四 | 100 | 100 |
试剂五 | 20 | 20 |
试剂六 | 20 | 20 |
混匀，室温静置10min,于700nm处读取吸光值A,△A=A测定-A对照(每个样本需做一个自身对照)。 |
注: 若△A 值在零附近徘徊，可在37℃孵育阶段延长反应时间 T(如增至3h 或更长),或增加土壤样本量 W (如增至0.2g), 则改变后的反应时间 T 和 W需代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.5788x-0.0004,x是标准品摩尔浓度(μmoL/mL),y 是△A。
2、酶活定义：
37℃条件下，每克土样每小时释放出1μmol 的无机磷为一个酶活力单位。
土壤核酸酶活性(μmol/h/g 土样)=(△A+0.0004)÷0.5788×V1÷W÷T=0.864×(△A+0.0004)÷W
V1--- 孵育阶段的反应总体积，1mL;T---反应时间，2h;W--- 样本质量，g;
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5μmoL/mL): 标准品用10mL 蒸馏水溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液用试剂一稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5. μmoL/mL.
也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
