土壤芳基酰胺酶活性检测试剂盒/24样
测定意义：
土壤芳基酰胺酶 (Aryl-acylamidase,EC 3.5.1.13)可水解带有酰胺基团的化合物；本试剂盒利用土壤芳基酰胺酶水解底物 L-亮氨酸β-萘胺生成β-萘胺，β-萘胺接着与对二甲氨基肉桂醛生成红色偶氮化合物，该化合物于540nm 处有特征吸收峰，通过检测该红色物质的增加速率，即可计算土壤芳基酰胺酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加入6mL蒸馏水，充分溶解备用。 |
试剂三 | 液体14mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体mL×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加入6mL蒸馏水，充分溶解备用。 |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、天平、离心机、恒温水浴锅、乙醇、 可调式移液器。
土壤芳基酰胺酶活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取新鲜土样风干或者30℃烘箱风干，先粗研磨，过40目筛，备用。
注: 土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm, 蒸馏水调零。
② 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 0.1g土壤 | 0.1g土壤 |
试剂一 | 300 | 300 |
试剂二 | 100 | |
混匀，37℃振荡培养2h(间隔30min振荡混匀一次)。 |
95%乙醇 | 600 | 600 |
试剂二 | | 100 |
立即混匀，于012000rpm,室温或4℃离心10min,离心10min, 上清液待测。 |
③显色反应，在 EP 管中依次加入：
上清液 | 280 | 280 |
试剂三 | 280 | 280 |
试剂四 | 280 | 280 |
混匀，10min后，全部液体转移至1mL玻璃比色皿(光径1cm)中，于540nm处测定吸光值A,△A=A测定-A对照(每个样本做一个自身对照)。 |
注:
1、若△A 值在零附近徘徊，可在37℃孵育阶段延长反应时间 T(如增至3h 或更长), 或增加土壤样本量 W (如增至0.2g), 则改变后的反应时间 T 和 W 需代入公式重新计算。
2、若 A 测定的值大于1.8,可用乙醇对整个红色显色反应液进行稀释，则稀释倍数 D 需代入公式参与计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y =0.0546x-0.016,x是标准品浓度(μg/mL),y是△A。
2、 酶活定义：
37℃条件下，每克土样每小时释放出1 μg 的β-萘胺为一个酶活力单位。
土壤芳基酰胺酶活性(μg/h/g土样)=(△A+0.016)÷0.0546×V1÷W÷T =9.2×(△A+0.016)÷WV1---孵育阶段的反应总体积，1mL;T---反应时间，2h;W--- 样本质量，g;
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(2.5mg/mL): 标准品用1mL 乙醇溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0,5,10,15,20,25. μg/mL 。 也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
