土壤焦磷酸酶(S-PPase)活性检测试剂盒/24样
测定意义：
土壤焦磷酸酶(焦磷酸盐磷酸水解酶， EC 3.6.1.1) 催化焦磷酸盐水解成正磷酸盐。在土壤有机磷的矿化和转化中发挥重要作用。
本试剂盒提供一种简单、灵敏、快速的检测方法。土壤焦磷酸酶催化焦磷酸盐水解成磷酸盐。可通过在700nm 处测定生成的无机磷量来确定该酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体300mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加入 30mL试剂一，充分溶解备用。 |
试剂三 | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 临用甩几下使试剂落入底部，再加4.2mL蒸馏水，混匀溶解备用 |
试剂五 | 粉体mg×7支 | 4℃保存 | 临用甩几下使试剂落入底部，每支再加 1.5mL蒸馏水,混匀溶解备用,现配现用。 |
标准品 | 粉体1mL×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
注 : 全程操作需无磷环境；试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、 台式离心机、恒温培养箱、分析天 平、可调式移液器。
土壤芳基酰胺酶活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取新鲜土样或者37度烘箱风干(需先粗研磨),过40目筛网备用。
注 : 土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30 min, 调节波长到700 nm, 蒸馏水调零。
② 反 应 mix 制备：试剂四和五按照要求加蒸馏水溶解后，按试剂三：四：五=10:2:5的比例依次混合配置(需现配现用，若出现蓝色则需弃掉重新配置)。
③ 在离心管中依次加入下列试剂：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
土壤样本(g) | 0.1 | 0.1 |
试剂一 | 550 | 550 |
试剂二 | 50 | |
混匀，37℃振荡培养2小时(间隔30min振荡混匀一次)。 |
试剂三 | 300 | 300 |
试剂四 | | 50 |
立即混匀，于12000rpm,室温或4℃离心5min,上清液需立即测定，不可久置。 |
③ 显色反应，在EP管或1mL玻璃比色皿中依次加入：
上清液 | 40 | 160 |
反应mix | 100 | 100 |
混匀，室温静置10min,于700nm处读取吸光值A,△A=A测定-A对照(每个样本需做一个自身对照)。 |
注:
1、若△A 的值在零附近，可延长孵育时间 T (如增至5h)。
2、若是同时检测同一背景下的土壤样本(如同一批样本不同时间点的取样),此批土壤样本可做一个批次的样本自身对照，节省时间。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.9007x-0.0012;x是标准品摩尔浓度(μmol/mL),y是△A
2、活性定义：
在37℃,每克土壤每小时水解1μmol焦磷酸产生1μmol无机磷定义为1个酶活单位。
土壤焦磷酸酶(μmol/h/g 土样)=(△A+0.0012)÷0.9007×V1÷W÷T =0.5×(△A+0.0012)÷WV1---孵育阶段整个反应体积：900 μL=0.9mL;W---土壤样品质量，g;T--- 催化反应时间，2h;
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5μmoL/mL): 标准品用10mL蒸馏水溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
