土壤焦磷酸酶(S-PPase)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
土壤焦磷酸酶（焦磷酸盐磷酸水解酶 ，EC 3.6.1.1）催化焦磷酸盐水解成正磷酸盐。在土壤有机磷的矿化和转化中发挥重要作用。
本试剂盒提供一种简单、灵敏、快速的的检测方法。土壤焦磷酸酶催化焦磷酸盐水解成磷酸盐。可通过在 700nm 处测定生成的无机磷量来确定该酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再3.2mL蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂二 | 粉体 mg×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体32mL×1瓶 | 4℃保存 | 临用甩几下使试剂落入底部，再加 2.2mL蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂四 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 临用甩几下使试剂落入底部，再加4.2mL蒸馏水，混匀溶解备用 |
试剂五 | 粉体mg×4支 | 4℃保存 | 临用甩几下使试剂落入底部，每支再加1.5mL蒸馏水，混匀溶解备用，现配现用。 |
标准品 | 粉体1mL×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
注：全程操作需无磷环境；试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
所需的仪器和用品：
酶标仪、 96孔板、台式离心机、恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、蒸馏水。
土壤焦磷酸酶活性测定:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 酶标仪预热30 min，调节波长到700 nm。
② 反应 mix 制备：试剂四和五按照要求加蒸馏水溶解后，按试剂三：四：五=10:2:5的比例依次混合配置（需现配现用，若出现蓝色则需弃掉重新配置）。
③ 在离心管中依次加入下列试剂：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
土壤样本(g) | 0.1 | 0.1 |
试剂一 | 370 | 370 |
试剂二 | 30 | |
混匀，37℃振荡培养2h（间隔30min振荡混匀一次） |
试剂三 | 200 | 200 |
试剂二 | | 30 |
立即混匀，于12000rpm,室温或4℃离心5min,上清液需立即测定，不可久置。 |
③ 显色反应，在 96 孔板中依次加入：
上清液 | 50 | 50 |
反应mix | 150 | 150 |
混匀，室温静置10min,于700nm处读取吸光值A,△A=A测定-A对照(每个样本需做一个自身对照)。 |
注:
1、若△A 的值在零附近，可延长孵育时间 T（如增至5h）。
2、若是同时检测同一背景下的土壤样本（如同一批样本不同时间点的取样） ，此批土壤样本可做一个批次的样本自身对照，节省时间。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.5987x - 0.0003 ；x 是标准品摩尔浓度(μmol/mL）， y是△A。
2、活性定义：
在37℃,每克土壤每小时水解1μmol 焦磷酸产生1μmol无机磷定义为1个酶活单位。
土壤焦磷酸酶(μ mol/h/g 土样)=(△A+0.0003) ÷0.5987 ×V1 ÷W÷T =0.5 × (△A+0.0003)÷WV1---孵育阶段整个反应体积：600μL=0.6mL； W---土壤样品质量，g；T---催化反应时间，2 h；
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（5μmoL/mL）：标准品用10mL蒸馏水溶解。（母液需在两天内用）。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0 ，0.2 ，0.4 ，0.6 ，0.8，1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
