土壤甘氨酸氨基肽酶(S-GAP)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
土壤甘氨酸氨基肽酶（S-GAP）是一类能水解肽链 N-末端为甘氨酸的酶 ，由土壤微生物分泌。本试剂盒利用土壤甘氨酸氨基肽酶（S-GAP）分解甘氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，该物质在 405nm 有大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 S-GAP 活性。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下，使试剂落入底部，再加 5.4mL乙醇混匀溶解。 |
试剂三 | 液体35mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、 96孔板、台式离心机、恒温振荡培养箱/水浴锅、可调式移液器、天平。
土壤甘氨酸氨基肽酶(S- GAP)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取新鲜土样或干土（风干或者 37 度烘箱风干），先粗研磨，过40目筛网备用。
注：土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻；
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min，调节波长到405nm。
② 在 EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 空白管(仅做一次) |
土样(g) | 0.05 | 0.05 | |
试剂一 | 400 | 500 | 400 |
试剂二 | 100 | | 100 |
充分混匀，37℃培养2小时(振荡培养或间隔20min手动振荡混匀几下)。 |
试剂三 | 300 | 300 | 300 |
混匀，8000rpm离心 5min（若上清液不澄清可加大离心力），取200μL 上清液至 96孔板中，405nm 下读取吸光值 A，△A= A测定- A对照-A空白（每个样本做一个自身对照）。 |
注:
1、若ΔA 较小，可延长 37℃的孵育时间 T（如增至 4 小时或更长），或增加土样质量 W（如增至 0.2g）。则改变后的 T 和 W 需代入计算公式重新计算。
2、若测定管 A 值大于1.5 或△A 大于1.5，可缩短 37℃的孵育时间 T（如减至0.5 小时或更短）。则改变后 T 需代入计算公式重新计算。或对后一步的待检测上清液（包括测定管、对照管和空白管）同时用蒸馏水进行稀释，稀释倍数D 代入计算公式。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y = 0.0077x - 0.0024 ；x为标准品摩尔质量（nmol），y 为△A。
2、单位定义：
每小时每克土样生成1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。
S-GAP(nmol/h/g 土样)=(ΔA+0.0024)÷0.0077 ÷W÷T × D=65 × (ΔA+0.0024)÷W × DT---反应时间，2h；W---土壤样本实际取样量，g。D---稀释倍数，未稀释即为 1。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（10μmol/mL）：临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，加入 0.5mL乙醇，涡旋震荡溶解后再加入 0.5mL 的蒸馏水混匀，得到10μmol/mL备用。
2、把母液用蒸馏水稀释成以下浓度：0,0.4,0.8,1.2,1.6, 2 μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、在EP管依次加入：50μL标准品+450μL 试剂一+300μL 试剂三，混匀，取200 μL至96孔板中，于405nm下读取吸光值，根据结果制作标准曲线。
