土壤β-半乳糖苷酶(S-β-GAL)活性检测试剂盒/24样
测定意义：
土壤β-半乳糖苷酶(β-GAL,EC 3.2.1.23)又称β-D- 半乳糖苷半乳糖基转移酶，参与土壤中碳水化合物的水解。本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法，β-GAL 分解对-硝基苯-β-D- 吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚 (PNP), 后者在405nm 有大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL 活性。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 粉剂mg×1瓶 | -20℃保存 | 临用前加入4.5mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存。 |
试剂二 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、可调式移液器、天平、低温离心机、蒸馏水。
土壤β-半乳糖苷酶(S-β-GAL)酶活检测：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取新鲜土样或干土(风干或者37 度烘箱风干),先粗研磨，过40目筛网备用。
注: 土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻。
2、测定步骤：
① 可见分光光度计预热30 min, 调节波长到405 nm, 蒸馏水调零。
② 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 空白管(仅做一次) |
土样(g) | 0.1 | 0.1 | |
试剂一 | 150 | | 150 |
蒸馏水 | | 150 | |
试剂二 | 300 | 300 | 300 |
混匀，37℃振荡反应1h。 |
试剂三 | 350 | 350 | 350 |
混匀，12000rpm室温离心10min,取全部上清液转移至1mL玻璃比色皿(光径1cm)中，405nm下读取吸光值A,△A=A测定-A对照-A空白(每个样本做一个自身对照)。 |
注:
1、若△A 在零附近徘徊，可延长37℃的孵育时间 T (如增至4小时或更长),或增 加土样质量 W (如增至0.2g) 。则改变后的T和 W需代入计算公式重新计算。
2、若测定管 A 值大于1.5 或△A 大于1.5,可缩短37℃的孵育时间 T (如减至0 .5小时或更短)。则改变后 T需代入计算公式重新计算。或对后一步的待检测上清液(包括测定管、对照管和空白管)同时用蒸馏水进行稀释，稀释倍数 D代入计算公式。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y =0.1461x+0.0087;x 为标准品质量(μg),y 为△A。
2、单位定义：
每小时每克土样中产生1nmol对-硝基苯酚 (PNP) 定义为一个酶活单位。
S-β-GAL活力(nmol/h/g土样)=(△A-0.0087)÷0.1461÷Mr×10³÷W÷T×D=49.2× (△A-0.0087)÷W×DT--- 反应时间，1h;W---实际称取土样质量，g;Mr---PNP相 对分子质量，139.11; D--- 稀释倍数，未稀释即为1。
附：标准曲线制作过程：
1、 制备标准品母液(1mg/mL): 向标准品 EP管里面加入1mL 蒸馏水。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL 。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、在 EP 管依次加入：20μL 标准品+130μL 蒸馏水+300 μL 试剂二+350 μL 试剂三，混匀，全部上清液转移至1mL 玻璃比色皿(光径1cm) 中，于405nm下读取吸光值。
4、根据结果制作标准曲线。
