土壤精氨酸脱氨酶活性检测试剂盒/48样
测定意义：
氮素是限制植物生长发育的主要营养元素之一，土壤氮素是植物氮素营养的主要来源。其中土壤精氨酸脱氨酶也与土壤中氮转化有着密切关系。
本试剂盒利用精氨酸脱氨酶水解精氨酸生成 NH3-N，该产物在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，通过检测生成的有色物质在 630nm 的大光吸收峰，进而得出土壤精氨酸脱氨酶活力大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 粉剂mg×2瓶 | 4℃保存 | 临用前加入18mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍4℃保存。 |
试剂二 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体6mL×1瓶 | 4℃保存 | 避光保存。 |
试剂四 | 液体3mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | A:液体3.5mL×2瓶
B:液体μL×1支 | 4℃保存 | 临用前取30μL的 B液进一瓶A液中，混匀后作为试剂五使用。混匀后的试剂五一周内用完。 |
标准品 | 液体1mL×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔 板、水浴锅或恒温培养箱、离心机、可调式移液器、蒸馏水 。
土壤精氨酸脱氨酶活性测定:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取新鲜土样或干土（风干或者 37度烘箱风干），先粗研磨，过40目筛网备用。
2、上机检测：
① 培养：取EP管依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
土样(g) | 0. 5 | 0. 5 |
试剂一 | 600 | |
蒸馏水 | | 600 |
混匀，放入37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育3小时。 |
试剂二 | 600 | 600 |
震荡提取30min,8000rpm,25℃离心5min,取上清液。 |
② 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 630nm。
③ 显色反应：在 96 孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
上清液 | 15 | 15 |
蒸馏水 | 45 | 45 |
试剂三 | 60 | 60 |
试剂四 | 30 | 30 |
试剂五 | 60 | 60 |
混匀，37℃放置20min后，于630nm读取吸光值A,全部液体转移至1mL玻璃比色皿(光径1cm)中△A=A测定管-A对照管(每个样本做一个自身对照)。 |
注:
1、试剂三和四和五需分开加，不能事先混匀。
2、若ΔA 值较小，可增加 37℃孵育时间 T（如由 3 小时增至 6 小时或更多）或在显色反应阶段增加上清液量 V1(如增至 30 μL，则蒸馏水体积相应减少)；则改变后的 T 和 V1需代入计算公式重新计算。
3、若 A 测定的值大于1.5，可在显色反应阶段减少上清液的量 V1(如减至5μL，则蒸馏水体积相应增加)；则改变后的上清液体积 V1 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：y = 5.0935x - 0.0031 ；x 为标准品质量(μg），y 为吸光值ΔA 。
2、土壤酶活定义：每天每克土样中产生 1 μg 的 NH3-N 定义为一个酶活力单位。
土壤精氨酸脱氨酶活力(μg/d/g 土样)=(ΔA+0.0031)÷ 5.0935 × (V ÷V1) ÷W÷T=125.7 × (ΔA+0.0031)÷WV---反应总体积， 1200 μL； V1---显色反应中上清液体积， 15 μL；T---反应时间，3h=1/8d； W---土壤样本实际取样质量，g。
附：标准曲线制作过程：
1、把标准品母液（1mg/mL），用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品 ：0 ，2 ，4 ，6 ，8，10. μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
2、在显色反应阶段，按照测定管加样表操作，依据结果即可制作标准曲线。
