腺苷脱氨酶(ADA)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
腺苷脱氨酶（ADA ，EC 3.5.4.4）是一种琉基酶，是嘌呤核苷酸代谢的关键酶，与机体细胞的免疫活性有重要关系。腺苷脱氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷水解，产生次黄嘌呤核苷和氨，利用氨在强碱的环境下与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液颜色稳定。其在 630nm 处有特征吸收峰，通过检测氨增加的速率，即可计算该酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 1 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×2瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，每瓶再加11ml加蒸馏水溶解备用。 |
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体24mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂六 | A：液体7mL×4瓶 B：液体μL×1支
| 4℃保存 | 临用前取60μL的B液进一瓶A液中，混匀后作为试剂六使用。混匀后的试剂六一周内用完。 |
标准品 | 液体mL×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、台式离心机、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水。
腺苷脱氨酶(ADA)活性测定:
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分足的样本可取 0.2-0.5g), 加入1mL 提取液；进行冰浴匀浆。12000rpm ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例提取。
② 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 630nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温（25℃),在 EP 管依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 80 | 80 |
试剂一 | 200 | 200 |
试剂二 | 200 | |
试剂三 | | |
混匀 ， 放入37 ℃水浴锅或恒温培养箱中孵育30min 。 |
试剂二 | | 200 |
试剂三 | 200 | |
混匀，室温 12000rpm 离心 10min，上清液待测。 |
③ 显色反应：在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
上清液(上步反应 ) | 60 | 60 |
蒸馏水 | 180 | 180 |
试剂四 | 240 | 240 |
试剂五 | 120 | 120 |
试剂六 | 240 | 240 |
混匀，37℃放置20min后，于630nm读取吸光值A,全部液体转移至1mL玻璃比色皿(光径1cm)中△A=A测定管-A对照管(每个样本做一个自身对照)。 |
注：
1、试剂四和五和六需分开加，不能事先混匀。
2、若ΔA 的值较小，可增加 37℃孵育时间（如增至1小时或更长），或在显色阶段增加上清液量 V1(如增至 120 μL，则蒸馏水体积相应减少)；则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
3、若A测定大于1.8，可减少37℃孵育时间（如减至10min或更短）， 或在显色阶段减少上清液量 V1(如减至30 μL，则蒸馏水体积相应增加)；则改变后的 T和 V1需代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y =23.259x - 0.0071 ；x 为标准品摩尔质量(μmoL），y 为吸光值ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克蛋白质每小时催化腺苷生成1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。
ADA ( μmoL/h/mg prot)=(ΔA+0.0071)÷23.259 × (V2 ÷V3) ÷ (V1 ×Cpr) ÷T=12.2 × (ΔA+0.0071)÷Cpr。
3、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织每小时催化腺苷生成1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。
ADA ( μmoL/h/g 鲜重)=(ΔA+0.0071)÷23.259 × (V2 ÷V3) ÷ (W ×V1÷V) ÷T=12.2 × (ΔA+0.0071)÷W
4、按照液体体积计算：
单位定义：
每毫升液体每小时催化腺苷生成1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。
ADA ( μmoL/h/mL)=(ΔA+0.0071)÷23.259 × (V2 ÷V3) ÷V1÷T=12.2 × (ΔA+0.0071)
V---提取液体积， 1mL；V1----加入②歩反应体系中样本体积，0.08mL；V2---②歩反应体系总体积：0.68mL； V3---③歩显色步骤中上清液体 积，0.06mL； T---反应时间，0.5h； W---样本质量；Cpr---样本蛋白质浓 度,mg/mL,建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、标准品母液（10μg/mL 的氨（分子量是18），把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
2、按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
