天冬酰胺酶(ASNase/asparaginase)活性检测试剂盒/96样
测定意义：
天冬酰胺酶（ EC 3.5.1.1，ASNase）是一种酰胺水解酶，能够将 L-天冬酰胺脱去氨基生成L-天冬氨酸和氨。该酶具有抗肿瘤活性，在食品和医药等领域应用十分广泛。
天冬酰胺酶（ASNase）催化天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，利用氨在强碱的环境下与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液颜色稳定。其在 630nm 处有特征吸收峰，通过检测氨增加的速率，即可计算该酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×2瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，每瓶再加11ml蒸馏水溶解备用。 |
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体6mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂六 | A：液体3.5mL×4瓶
B：液体μL×1支
| 4℃保存 | 临用前取30μL的B液进一瓶A液中，混匀后作为试剂六使用,混匀后的试剂六一周内用完。 |
标准品 | 液体×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、台式离心机、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水 。
天冬酰胺酶( ASNase)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分足的样本可取 0.2-0.5g），加入1mL 提取液；进行冰浴匀浆.12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液(mL)为500~1000：1的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 630nm。
② 所有试剂解冻至室温（25℃),在 EP 管依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 40 | 40 |
试剂一 | 100 | 100 |
试剂二 | 100 | |
试剂三 | | |
混匀，放入37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育1h。 |
试剂二 | | 100 |
试剂三 | 100 | |
混匀，室温 12000rpm 离心 10min，上清液待测。 |
③ 显色反应：在 96 孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
上清液(上步反应 ) | 30 | 30 |
蒸馏水 | 30 | 30 |
试剂四 | 60 | 60 |
试剂五 | 30 | 30 |
试剂六 | 60 | 60 |
充分混匀，37℃放置20min后，于630nm处读取吸光值A,△A=A测定管-A对照管(每个样 本做一个自身对照)。 |
注 : 1、试剂四和五和六需分开加，不能事先混匀。
2、若ΔA的值较小，可增加 37℃孵育时间（如增至1小时或更长） ，或在显色阶段增加上清液量 V1(如增至60μL，则蒸馏水体积相应减少)；则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
3、若A测定大于1.5可减少37℃孵育时间（如减至 0.5 小时或更短），或在显色阶段减少上清液量 V1(如减至15μL，则蒸馏水体积相应增加)；则改变后的 T 和 V1 需代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y = 3.229x - 0.0118 ；x 为标准品质量(μg），y 为吸光值ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克蛋白质每小时催化腺苷生成1μmoL 氨定义为一个酶活力单位。
ASNase (μg/h/mg prot)=(ΔA+0.0118)÷3.229×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T=87.75 ×(ΔA+0.0118)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织每小时催化天冬酰胺生成1μg 氨定义为一个酶活力单位。
ASNase (μg/h/g鲜重)=(ΔA+0.0118) ÷ 3.229 × (V2 ÷ V3) ÷ (W × V1 ÷ V) ÷T=87.75 × ( Δ A+0.0118) ÷W
4、按细胞数量计算：
单位定义：
每10⁴个细胞每小时催化天冬酰胺生成1μg氨定义为一个酶活力单位。
ASNase(μg/h/10⁴ cell)=(ΔA+0.0118)÷3.229×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T=0.18 ×(Δ A+0.0118)÷W
5、按照液体体积计算：
单位定义：
每毫升液体每小时催化天冬酰胺生成1μg氨定义为一个酶活力单位。
ASNase(μg/h/mL)=(ΔA+0.0118)÷3.229×(V2÷V3)÷V1÷T=87.75×(ΔA+0.0118)÷WV---提取液体积,1mL； V1---加入②歩反应体系中样本 体积，0.04mL；V2---②歩反应体系总体积：0.34mL； V3---③歩显色步骤中上清液体积，0.03mL； T---反应时间， 1h； W---样本质量； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、标准品母液（10μg/mL的氨)，把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
2、按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
