芳基酰胺酶活性检测试剂盒 /48样

芳基酰胺酶活性检测试剂盒 /48样

测定意义： 

芳基酰胺酶(aryl-acylamidase) (EC 3. 5. 1.3)，广泛存在于动物、植物、微生物中，可水解带有酰胺基团的化合物，是生物体内农药及其他外源物质的重要水解酶之一。本试剂盒采用芳基酰胺酶水解底物产生对硝基苯胺，在波长 405nm 处有大吸收峰。通过检测生成的产物对硝基苯胺在 405nm 处的增长速率即可得出该酶活性大小。

试剂盒组成和配制：

所需的仪器和用品：

可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、乙醇、冰和蒸馏水。

芳基酰胺酶活性测定:

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!

1、样本制备：

① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入  1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心  10min，取上清，置冰上待测。

注：若增加样本量，可按照组织质量（g）： 提取液体积(mL)为1： 5~10  的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声  3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴)：提取液(mL)为500~1000：1的比例进行提取

③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、上机检测：

① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。

② 所有试剂解冻至室温（25℃) 。

③ 在1mL玻璃比色皿中依次加入：

注： 

1、加完试剂二即启动反应，所以试剂二加完混匀后立即检测，若A2值大于1.5，可对样本进行稀释，稀释倍数需代入公式重新计算。

2、若 ΔA 小于 0.005，可增大样本量 V1（如增至 320μL，试剂一相应减少），则改变后的 V1需代入公式重新计算。

结果计算：

1、标准曲线方程：

       y = 0.0117x + 0.0041：x为标准品(nmoL) ，y为ΔA。。

2、按样本鲜重计算：

      酶活定义：

      在 37℃,每克组织每分钟催化产生1nmoL 标准品定义为一个酶活单位（U）。

      芳基酰胺酶(nmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0041)÷0.0117] ÷ (W ×V1÷V) ÷T=17.806 × (ΔA-0.0041)÷W

3、按样本蛋白浓度计算：

      酶活定义：

      在 37℃,每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmoL 标准品定义为一个酶活单位（U）。

      芳基酰胺酶(nmoL/min/mg prot)= [(ΔA-0.0041)÷0.0117] ÷ (V1 ×Cpr) ÷T =17.806 × (ΔA-0.0041)÷Cpr

4、按细胞数量计算：

      酶活定义：

      在37℃,  每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmoL标准品定义为一个酶活单位（U）。

      芳基酰胺酶(nmoL/min/10⁴cell)= [(ΔA-0.0041)÷0.0117] ÷ (500 ×V1÷V) ÷T=0.0356 × (Δ A-0.0041)

5、按照液体体积计算：

      酶活定义： 

      在37℃,每毫升液体每分钟催化产生1nmoL标准品定义为一个酶活单位（U）。

      芳基酰胺酶(nmoL/min/mL)= [(ΔA-0.0041)÷0.0117] ÷V1÷T=17.806 ×(ΔA-0.0041)V---加入提取液体积1mL;V1---加入样本体积,0.16mL;T-        --反应时间,30min；W---样本质量，g；500- --细胞数量；Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。

附：标准曲线制作过程：

1、制备标准品母液（10μmol/mL）：临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，加入 0.1mL乙醇，涡旋震荡溶解后再加入 0.9mL的蒸馏水混匀，得到10μmol/mL备用。

2、用蒸馏水把母液稀释成以下浓度：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。

3、160μL标准品+640μL 试剂一，混匀后于 405nm 处读取 A 值，依据结果即可制作标准曲线。