芳基酰胺酶活性检测试剂盒/96样
测定意义：
芳基酰胺酶(aryl-acylamidase)(EC3.5.1.3), 广泛存在于动物、植物、微生物中，可水解 带有酰胺基团的化合物，是生物体内农药及其他外源物质的重要水解酶之一。本试剂盒采用芳基酰胺酶水解底物产生对硝基苯胺，在波长405nm处有大吸收峰，通过检测生成的产物对硝基苯胺在405nm处的增长速率即可得出该酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体125mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体4mL×1支 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若要重新做标曲则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、离心机、可调式移液器、研钵、乙醇、冰和蒸馏水。
芳基酰胺酶活性测定:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0. 1g 组织，加入1mL试剂一，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm离心15min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W, 超声3s,间 隔10s,重复30次);12000rpm4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104):提取液 (mL)为500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30 min以上，调节波长到405nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 为了减少操作误差，建议使用排枪。
④ 依次在96孔板中加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
试剂一 | 120 |
样本 | 40 |
试剂二 | 40 |
混匀,立即于4 05 n m 处 读 取 A l 值 ， 3 7 ℃ 反 应 3 0 m i n 后 读 取 A 2 值 。△A=A2-Al。 |
注 :
1、加完试剂二即启动反应，所以试剂二加完混匀后立即检测，若A2值大于1 .5,可对样本进行稀释，稀释倍数需代入公式重新计算。
2、若△A 小于0.005,可增大样本量V1(如增至80μL, 试剂一相应减少),则改变后的V1 需代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线：
y=0.0279x-0.009:x为标准品(nmoL),y为△A。
2、按样本鲜重计算：
单位定义：
在37℃,每克组织每分钟催化产生1nmoL标准品定义为一个酶活单位(U)。
芳基酰胺酶(nmoL/min/g鲜重)=[(△A+0.009)÷0.0279]÷(W×V1÷V)÷T=29.87×(△A+0.009)÷W
3、按样本鲜重计算：
单位定义：
在37℃,每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmoL 标准品定义为一个酶活单位(U)。
芳基酰胺酶(nmoL/min/mgprot)=[(△A+0.009)÷0.0279]÷(V1×Cpr)÷T=29.87×(△A+0.009)÷Cpr
4、按细胞数量计算：
酶活定义：
在37℃,每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmoL 标准品定义为一个酶活单位(U)。
芳基酰胺酶(nmoL/min/10⁴cell)=[(△A+0.009)÷0.0279]÷(500×V1÷V)÷T=0.06×(△ A+0.009)
5、按照液体体积计算：
单位定义：
在37℃,每毫升液体每分钟催化产生1nmoL 标准品定义为一个酶活单位(U)。
芳基酰胺酶(nmoL/min/mL)=[(△A+0.009)÷0.0279]÷V1÷T=29.87×(△A+0.009)V---加入提取液体积,1 mL;V1--- 加入样本体积，0.04mL;T--- 反应时间，30min;W--- 样本质量，g;500---细胞数量；Cpr--- 样本蛋白质浓度，mg/mL,建议使用本公司的 BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(10μmol/mL):临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，加入0.1mL乙醇，涡旋震荡溶解后再加入0.9mL 的蒸馏水混匀，得到10μmol/mL备用。
2、用蒸馏水把母液稀释成以下浓度：0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。340μL标准品+160μL试剂一，混匀后于405nm处读取A值，依据结果即可制作标准曲线 。
