乙酰乳酸合成酶(ALS)活性检测试剂盒/24样
测定意义：
乙酰乳酸合成酶( ALS， EC 2.2.1.6) 是支链氨基酸生物合成途径中的一个关键酶，此生物合成过程只存在于植物和微生物体内，是绿色除草剂的重要作用靶标。
乙酰乳酸合成酶( ALS)可催化 2 分子的丙酮酸生成乙酰乳酸，该产物在硫酸作用下脱羧生成乙酰甲基甲醇，该产物与显色剂反应生成有色物质，该有色物质在 525nm 处有特征吸收峰，通过检测该有色物质的增加速率即可得出 ALS 酶活性大小。反应方程式：2 pyruvate =2-acetolactate+CO2。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，再加 1.2mL蒸馏水混匀溶解，仍 4℃保存。 |
试剂一 | 粉体mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体2mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉体×1 支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、蒸馏水。
乙酰乳酸合成酶(ALS)活性测定:
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）， 加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，4℃××12000rpm离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量（g）： 提取液体积(mL)为1： 5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴)：提取液（mL）为500~1000：1的
比例进行提取
③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min，调节波长为525nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂于25℃水浴中预热10 min。
③ 在EP管中依次加入下列试剂：
试剂名称(μL) | 样本管 | 对照管 |
试剂一 | 40 | |
试剂二 | 260 | 300 |
样本 | 100 | 100 |
35℃条件下，暗反应 1h。 |
试剂三 | 40 | 40 |
60℃条件下水浴脱羧 15min。 |
试剂四 | 200 | 200 |
试剂五 | 200 | 200 |
60℃下水浴显色 15min ，12000rpm离心5min ，取澄清上清液至1mL 玻璃比色皿（光径1cm），于 525nm 处读值。ΔA=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。 |
注：
若ΔA 的值非常低在零附近，可增加样本量V1（如增至200μL，则试剂二相应减少）或延长反应时间 T（如增至 2h 或更长），则重新调整的 V1 和T代入公式重新计。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y = 0.0156x + 0.0023，x是标准品乙酰甲基甲醇摩尔质量（nmol）；y 是△A。
2、按照样本质量计算：
酶活定义：
每克组织每小时催化底物产生1nmol乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。
ALS (nmol/h/g 鲜重)=[(△A-0.0023) ÷0.0156] ÷ (W ×V1÷V) ÷T × D=641 × (△A-0.0023) ÷ W × D
3、按照样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克蛋白每小时催化底物产生1nmol 乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。
ALS (nmol/h/mg prot)=[(△A-0.0023) ÷0.0156] ÷ (Cpr ×V1) ÷T × D =641 × (△A-0.0023) ÷ Cpr × D
4、按细菌数量计算：
酶活定义：
每10⁴个细胞每小时催化底物产生1nmol乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。
ALS (nmol/h/10⁴cell)=[(△A-0.0023)÷0.0156]÷(500×V1÷V)÷T×D=1.28×(ΔA-0.0023)× DW---样品质量，g；V---提取液体积，1 mL；V1---上清液体积（mL）,0.1mL;T---反应时间,1h。 D---稀释倍数，未稀释即为1；500---细胞数量，万；Cpr---上清液蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA蛋白质含量测定试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（1mg/mL）：向标准品EP管里面加入1mL蒸馏水混匀溶解。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0 ，0.01 ，0.02 ，0.03 ，0.04 ，0.05 mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据对照管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线，标准品乙酰甲基甲醇的摩尔质量为 88.11。
