乙酰乳酸合成酶(ALS)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
乙酰乳酸合成酶(ALS,EC2.2.1.6) 是支链氨基酸生物合成途径中的一个关键酶，此生物合 成过程只存在于植物和微生物体内，是绿色除草剂的重要作用靶标。乙酰乳酸合成酶(ALS)可催化2分子的丙酮酸生成乙酰乳酸，该产物在硫酸作用下脱羧生 成乙酰甲基甲醇，该产物与显色剂反应生成有色物质，该有色物质在525nm 处有特征吸 收峰，通过检测该有色物质的增加速率即可得出 ALS 酶活性大小。反应方程式：2 pyruvate =2-acetolactate+CO2.
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | ④℃保存 | |
试剂一 | 粉体mL×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，再加1.2mL蒸馏水混匀溶解，仍4℃保存。 |
试剂二 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体2mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉体×1 支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、离心机、可调式移液器、研钵、乙醇、冰和蒸馏水。
乙酰乳酸合成酶(ALS)活性测定:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0.2g 组织(水分充足的样本可取0.5g), 加 入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，4℃×12000rpm 离心15min, 取上清液待测。
注 : 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例提取
② 细菌/细胞样本：先收集细菌到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加 入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W, 超 声 3s, 间隔10s, 重 复30次);12000rpm 4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104):提取液 (mL)为500~1000:1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30 min, 调节波长为525nm。
② 所有试剂于25℃水浴中预热10 min。
③ 在EP管中依次加入下列试剂：
试剂名称(μL) | 样本管 | 对照管 |
试剂一 | 20 | |
试剂二 | 130 | 150 |
样本 | 50 | 50 |
35°℃条件下，暗反应1h |
试剂三 | 20 | 20 |
60℃条件下水浴脱羧15min |
试剂四 | 100 | 100 |
试剂五 | 100 | 10 |
60℃条件下水浴显色15min,12000rpm离心5min,取200μL澄清液体至96孔中 ，于525nm处读值 。△ A = A测定- A对照 ( 每个样本做一个自身对照)。 |
注 : 若△A 的值非常低在零附近，可增加样本量 V1 (如增至100μL,则试剂二相应减少)或延长反应时间 T (如增至2h 或更长),则重新调整的V1 和 T 代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线：
y=0.0217x-0.0003,x是标准品乙酰甲基甲醇摩尔质量(nmol);y是△A。
2、按照样本质量计算：
酶活定义：
每克组织每小时催化底物产生1nmol 乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。
ALS(nmol/h/g鲜重)=[(△A+0.0003)÷0.0217]÷(W×V1÷V)÷T×D=921.7×(△A+0.0003)÷W×D
3、按照样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克蛋白每小时催化底物产生1nmol 乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。
ALS(nmol/h/mgprot)=[(△A+0.0003)÷0.0217]÷(Cpr×V1)÷T×D=921.7×(△A+0.0003)÷Cpr×D
4、按细菌数量计算：
酶活定义：
每10⁴个细胞每小时催化底物产生1nmol乙酰甲基甲醇定义为一个酶活单位。
ALS(nmol/h/10⁴cell)=[(△A+0.0003)÷0.0217]÷(500×V1÷V)÷T×D=1.84×(△A+0.0003)×DW---样品质量，g;V--- 提取液体积，1 mL;V1--- 上清液体积 (mL),0.05mL;T---反应时间，1h。D--- 稀释倍数，未稀释即为1;500---细胞数量,万；Cpr--- 上清液蛋白质浓度,mg/mL; 建议使用本 公司的BCA蛋白质含量测定试剂盒
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(1mg/mL):向标准品EP管里面加入1mL蒸馏水混匀溶解。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据对照管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线，标准品乙酰甲基甲醇的摩尔质量为88.11。
