支链氨基酸转氨酶(BCAT)活性检测试剂盒/24样
测定意义：
支链氨基酸转氨酶(BCAT, E.C.2.6.1.42) 属于以磷酸吡哆醛作为辅酶的Ⅳ类转氨酶。该酶分布十分广泛，已经发现广泛存在于原核生物和大多数真核生物中。支链氨基酸转氨酶(BCAT)催化特异 L-型氨基酸氨基转移到α-酮戊二酸，形成相应的支链α -酮酸和谷氨酸；再用特异作用于谷氨酸的酶复合体分解谷氨酸，同时与显色剂反应生成黄色物质，该物质在 450nm 处有大吸收峰，进而得到支链氨基酸转氨酶(BCAT)的酶活性大小。该酶催化反应L-leucine+2-oxoglutarate=4-methyl-2-oxopentanoate+L-glutamate。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体55mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉体mL×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部，再加2.2mL的蒸馏水充分溶解，仍 4℃保存。 |
试剂二 | 粉剂 mg×1 支 | 4℃保存 | 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部，再加 1.2mL蒸馏水溶解备用。仍 4℃保存。 |
试剂三 | 粉剂 mg×1 支 | 4℃保存 | 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入管底部再加 1.1mL蒸馏水溶解备用。仍 4℃保存。 |
试剂四 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体4mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂六 | 粉剂 mg×1 支 | 4℃保存 | 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部，再加 1.1mL蒸馏水溶解备用。仍-20℃保存。 |
试剂七 | 液体1mL×1 支 | 4℃保存 | |
标准品 | 液体mL×1 支 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径1cm）、水浴锅、可调式移液器、研钵和蒸馏水。
支链氨基酸转氨酶(BCAT)活性检测:
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0.1g组织（水分多的样本取0.5g），加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。
② 细菌/细胞样：本先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，300W，超声3s，间隔7s ，总时间 3min）12000rpm， 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴)：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温（25℃),在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 40 | 40 |
试剂二 | 40 | |
试剂三 | 20 | 20 |
试剂四 | 200 | 200 |
样本 | 150 | 150 |
混匀,37℃反应 60min（准确时间）,立即于 95℃沸水中水浴 2min 后,上下振动几下混匀后，12000rpm室温离心5分钟,上清液待测。0℃下水浴显色 15min,12000rpm离心5min,取澄清上清液至1mL玻璃比色皿（光径1cm）,于525nm处读值。ΔA=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。 |
③ 显色反应：在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
提取液 | 370 | 370 |
试剂五 | 80 | 80 |
试剂六 | 20 | 20 |
试剂七 | 20 | 20 |
上清液 | 210 | 210 |
混匀,30℃反应15min，液体全部转移至 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中，立即于 450nm处读取吸光值A,△A=A 测定-A对照(每个样本需设一个自身对照)。 |
注： 若△A 差值在零附近徘徊，可以在显色反应阶段增加上清液（V3）的量（如增加到 300 μL，则提取液相应减少），则改变后的 V3 重新代入公式计算；或延长第②歩中 30℃反应时间T（如由60min增加至 90min），则改变后的反应时间T需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y = 0.0446x + 0.008；x 为谷氨酸摩尔质量（nmol），y 为△A。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白每小时生成1nmol的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
BCAT (nmol/h/mg prot)=[( ΔA-0.008) ÷ 0.0446] × (V2 ÷ V3)÷ (V1 × Cpr) ÷T=320.3 × (Δ A-0.008) ÷Cpr。
3、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织每小时生成1nmol的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
BCAT (nmol/h/g 鲜重)=[(ΔA-0.008) ÷ 0.0446] × (V2 ÷ V3) ÷ (W × V1 ÷ V) ÷T=320.3 × ( Δ A-0.008) ÷W。
4、按细菌或细胞密度计算：
单位定义：
每百万细菌或细胞每小时生成 1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
BCAT(nmol/h/10⁴cell)=[(ΔA-0.008) ÷ 0.0446] × (V2 ÷ V3) ÷ (500 × V1 ÷ V) ÷T=0.64 × ( Δ A-0.008)V--提取液体积， 1 mL；V1--加入 样本体积，0.15mL；V2--反应总体积，0.45mL；V3--显色阶段上清液体积，0.21mL；T--反应时间，60min=1h ；W--样本质量，g；500--- 细胞数量，百万；Cpr--样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司 BCA 蛋白含量测定试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、标准品母液（10nmol/μL）。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1. nmol/μL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段，测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。
