支链氨基酸转氨酶(BCAT)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
支链氨基酸转氨酶(BCAT,E.C.2.6.1.42) 属于以磷酸吡哆醛作为辅酶的IV类转氨酶。该酶分 布十分广泛，已经发现广泛存在于原核生物和大多数真核生物中。支链氨基酸转氨酶(BCAT催化特异 L-型氨基酸氨基转移到α-酮戊二酸，形成相应的支链α- 酮酸和谷氨酸；再用特异作用于谷氨酸的酶复合体分解谷氨酸，同时与显色剂反应生成黄色 物质，该物质在450nm 处有大吸收峰，进而得到支链氨基酸转氨酶(BCAT) 的酶活性大小。 该酶催化反应：L-leucine+2-oxoglutarate=4-methyl-2-oxopentanoate+L-glutamate。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部，再加2.2mL的蒸馏水充分溶解，仍4℃保存。 |
试剂二 | 粉剂mg×1 支 | 4℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部，再加1.2mL蒸馏水溶解备用。仍4℃保存。 |
试剂三 | 粉剂mg×1 支 | 4℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部，再加1.1mL蒸馏水溶解备用。仍4℃保存。 |
试剂四 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体2mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂六 | 粉剂 mg×1 支 | -20℃保存 | 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部，再加 1.1mL蒸馏水溶解备用。仍-20℃保存。 |
试剂七 | 液体1mL×1 支 | 4℃保存 | |
标准品 | 液体mL×1 支 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
支链氨基酸转氨酶(BCAT)活性检测:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0. 1g组织(水分多的样本取0.5g), 加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm, 4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌或细胞加入1mL 提取液；超声波破碎细菌或细胞(冰浴，300W, 超 声 3s, 间 隔 7s, 总 时 3min);12000rpm, 4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，按照细菌/细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL) 为500~1000:1 的比 例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm。
② 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 20 | 20 |
试剂二 | 20 | |
试剂三 | 10 | 10 |
试剂四 | 150 | 170 |
样本 | 100 | 100 |
混匀，37℃反应60min(准确时间),立即于95℃沸水中水浴2min后，上下振动几下混匀后，12000rpm室温离心5分钟，上清液待测。 |
③ 显色反应：在96孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
提取液 | 100 | 100 |
试剂五 | 20 | 20 |
试剂六 | 10 | 10 |
试剂七 | 10 | 10 |
上清液 | 60 | 60 |
混匀，30℃反应15min,立即于450nm处读取吸光值A,△A=A测定-A对照。(每个样本需设 一 个自身对照) |
注 : 若△A 差值在零附近徘徊，可以在显色反应阶段增加上清液(V3) 的量(如增加到120μL), 则提取液相应减少，改变后的 V3 重新代入公式计算；或延长第②歩中30℃反应时间 T(如由60min增加至90min), 则改变后的反应时间 T 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.106x-0.0032,x为谷氨酸摩尔质量 (nmol),y为△A。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白每小时生成1nmol的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
BCAT(nmol/h/mg prot)=[(△A+0.0032)÷0.106]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T=471.7×(△A+0.0032)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织每小时生成1nmol的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
BCAT(nmol/h/g鲜重)=[(△A+0.0032)÷0.106]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T=471.7×(△A+0.0032)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
单位定义：
每百万细菌或细胞每小时生成1nmol的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
BCAT(nmol/h/10⁴cell)=[(△A+0.0032)÷0.106]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T=0.94× (△A+0.0032)
V---提取液体积,1 mL;V1--- 加入样本体积，0.1 mL;V2---反应总体积，0.3mL;V3--- 显色阶段上清液体 0.06mL;T---反应时间,60min=1h;W--- 样本质量，g;500---细胞数量,百万；Cpr--- 样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用本公司BCA蛋白含量测定试剂盒；
附：标准曲线制作过程：
1、标准品母液(10nmol/μL)。
2、把母液稀释成六个梯度：0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1. nmol/μL。也可根据实际样本来调整浓度。
3、依据显色反应阶段，测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。
