淀粉去分支酶(DBE)检测试剂盒/24样
测定意义：
淀粉去分支酶(DBE)（ EC 3.2.1.68）属于淀粉水解酶家族，特异性地水解支链淀粉的α -1 ，6 糖苷键，产生线性的葡萄糖链，在调整支链淀粉分子的链长方面有重要的作用。采用 3 ，5-二硝基水杨酸法测定 DBE 催化支链淀粉产生的还原糖，通过测定还原糖 含量的变化来得到 DBE 酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体30mL×1瓶 | | |
试剂一 | 液体25mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下，使试剂落入底部，再加 18mL,于80℃水浴锅中溶解呈透明状态，待冷却后使用。 |
试剂三 | 液体25mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体8mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径1cm）、可调式移液器、水浴锅、台式离心机、研钵、冰、蒸馏水。
淀粉脱分支酶(DBE)活性检测:
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 12000rpm ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注 ：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。
2、上机检测：
① 可见分光光光度计预热 30min 以上，调节波长到540 nm，蒸馏水调零。
② 在 EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 30 | 30(95℃煮沸10min的酶液） |
试剂二 | 300 | 300 |
37 ℃ 孵育30min。 |
试剂三 | 420 | 420 |
试剂四 | 150 | 150 |
混匀，9 5 ℃显色10m i n后，流水冷却至室温后，全部液体转移至1mL玻璃比色皿中，于540nm处读取吸光值A，Δ A＝ A测定 - A对照 。 |
注 : 若ΔA 差值较小，可加大样本量，或延长孵育时间至1小时或更长。则改变后的加样量V1或反应时间T需重新代入公式计算。
结果计算：
1、标准曲线：
y=2.207x-0.0238 ，x 是标准品质量（mg），y 是ΔA。
2、按照蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每小时水解支链淀粉产生1mg 还原糖（以麦芽糖计）定义为一个酶活力单位。
DBE 活力(mg/h/mg prot)=[ (ΔA+0.0238)÷2.207] ÷ (V1 ×Cpr) ÷T =30.21 × (ΔA+0.0238)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每克组织每小时水解支链淀粉产生1mg还原糖(以麦芽糖计)定义为一个酶活力单位。
DBE 活力(mg /h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0238)÷2.207]÷ (W ×V1÷V) ÷T =30.21×(ΔA+0.0238)÷WV----加入提取液体积,1mL;V1----反应中样 品体积,30μL=0.03mL;W----样品质量g;T----反应时间,30min=0.5h;Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒；
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（50mg/mL）：临用前加1mL蒸馏水，充分溶解混匀。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,5,10,15,20, 25mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按照测定管加样体系操作，依据结果即可制作标准曲线。
