淀粉去分支酶(DBE)检测试剂盒/48样
测定意义：
淀粉去分支酶(DBE)(EC3.2.1.68) 属于淀粉水解酶家族，特异性地水解支链淀粉的α-1,6 糖苷键，产生线性的葡萄糖链，在调整支链淀粉分子的链长方面有重要的作用。采用3,5-二硝基水杨酸法测定 DBE 催化支链淀粉产生的还原糖，通过测定还原糖含量的 变化来得到 DBE 酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下，使试剂落入底部，再加24mL试剂一，于80℃水浴锅中溶解呈透明状态，待冷却后使用。 |
试剂三 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、可调式移液器、水浴锅、台式离心机、研钵、冰、蒸馏水
淀粉脱分支酶(DBE)活性检测:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
称取约0 . 1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min以上，调节波长到540 nm。
② 在EP管中依次加入：
试剂名称 | 测定管 | 对照管 |
样本 | 20 | 20（95℃煮沸10min的酶液） |
试剂二 | 200 | 200 |
37 ℃ 孵育30min。 |
试剂三 | 280 | 280 |
试剂四 | 100 | 100 |
混匀,95°℃显色10min后，流水冷却至室温后，取出200μL至96孔板中，于540nm处读取吸光值A,△A=A测定-A对照。 |
注: 若△A 差值较小，可加大样本量，或延长孵育时间至1小时或更长。则改变后的加样量V1 或反应时间T需重新代入公式计算。
结果计算：
1、标准曲线：
y=2.5359x-0.0196,x是标准品质量 (mg),y是△A。
2、按照蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每小时水解支链淀粉产生1mg还原糖(以麦芽糖计)定义为一个酶活力单位。
DBE 活力(mg/h/mgprot)=[(△A+0.0196)÷2.5359]÷(V1×Cpr)÷T=39.43×(△A+0.0196)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每克组织每小时水解支链淀粉产生1mg还原糖(以麦芽糖计)定义为一个酶活力单位。
DBE 活力(mg/h/g鲜重)=[(△A+0.0196)÷2.5359]÷(W×V1÷V)÷T=39.43×(△A+0.0196)÷WV----加入提取液体 积,1mL;V1---- 反应中样品体 积,20μL=0.02mL;W----样品质量，g;T---- 反应时30min=0.5h;Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒；
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(50mg/mL): 临用前加1mL 蒸馏水，充分溶解混匀。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,5,10,15,20,25mg/mL. 也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按照测定管加样体系操作，依据结果即可制作标准曲线。
