α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)检测试剂盒/24样
测定意义：
α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）是一种水解酶，可以水解人们日常饮食中常见的黄酮苷类化合物。该酶广泛分布于自然界的细菌和真菌等生物中。它在工业上具有许多潜在的应用价值。本试剂盒采用对硝基酚-α-鼠李糖苷(PNPR)作为底物，生成黄色的对硝基苯酚（PNP）， 该产物在 405nm 处有大吸收峰。通过检测PNP在405nm下的增加速率，即可得到α-L-鼠李糖苷酶活性的大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下或离心使试剂落入底部，再加蒸馏水溶解混匀，若难溶解可超声容解 |
试剂二 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、恒温培养箱、研钵、蒸馏水。
α-L-鼠李糖苷酶活性测定:
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆，4℃×12000rpm离心15min，取上清液待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）； 12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴)： 提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提。
③ 液体样本：可直接测定，或者适当稀释后测定。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30 min，调节波长为405nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂于 40℃水浴中预热 20 min。
③ 在1mL玻璃比色皿（光径1cm）中依次加入下列试剂：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 40 | 40 |
试剂一 | 80 | |
试剂二 | 280 | 360 |
迅速混匀 ， 40 ℃保温20min 。 |
试剂三 | 400 | 400 |
混匀，液体全部转移至1mL玻璃比色皿（光径1cm）中，立即于405nm下读取吸光值A，ΔA=A测定-A对照（每个测定管需设一个对照管） |
注：
① 若△A 的值非常低在零附近，可增加样本量 V1（如增至80μL，则试剂二相应减少）或延长反应时间T（如增至30min或更长)， 则重新调整的 V1 和 T 须代入公式重新计算。
② 若△A 的值超过1，则需要稀释样本，稀释倍数D代入计算公式；
结果计算：
1、标准曲线：
y = 21.604x -0.0022，x是标准品（PNP）摩尔质量：μmol；y是△A。
2、按照蛋白浓度计算：
酶活定义：
在 40℃下，每克组织每小时水解1μmoLPNPR 产生PNP定义为1个酶活单位。
Α-L-鼠李糖苷酶(μ mol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0022) ÷21.604] ÷(W×V1÷V÷T×D=3.47× (△A +0.0022)÷W × D。
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：
在 40℃下，每毫克蛋白每小时水解1μmoLPNPP 产生PNP 定义为1个酶活单位。
α-L-鼠李糖苷酶(μ mol/h/mg prot)=[(△A+0.0022)÷21.604]÷(Cpr×V1)÷T×D=3.47× (△A+0.0022) ÷Cpr×D。
4、按细胞数量计算：
酶活定义：
在 40℃下，每 10⁴个细胞每小时水解1μmoLPNPP产生PNP 定义为1酶活单位。
α-L-鼠李糖苷酶(μ mol/h/10⁴cell)=[(△A+0.0022) ÷21.604] ÷ (500 ×V1)÷T × D=0.007 × (△A +0.0022) × D。
5、按液体体积计算：
酶活定义：
在 40℃下，每毫升液体每小时水解1μmoLPNPP 产生PNP 定义为1个酶活单位。
α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mL)= [(△A+0.0022) ÷ 21.604] ÷V1÷T × D =3.47 × (△A +0.0022)W---样品质量,g；V---提取液体积,1 mL；V1--- 上清液体积mL）,0.04mL；T---反应时间,20 min=1/3h；D---稀释倍数,未稀释即为1；Cpr---上清液蛋白质浓度,mg/mL；建议使用本公司的 BCA蛋白质含量测定试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（10μ mol /ml）：向标准品EP管里面加入1mL 蒸馏水溶解，若有结晶析出，需 37℃水浴至完全溶解。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 μ mol/ml。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据40ul的标准品+360ul 的试剂二，再加 400ul 的试剂三，于 405nm 处读值；根据结果即可制作标准曲线。
