α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)检测试剂盒/48样
测定意义：
α-L- 鼠李糖苷酶(α-L-rnhamnosidase,EC 3.2.1.40) 是一种水解酶，可以水解人们日常 饮食中常见的黄酮苷类化合物。该酶广泛分布于自然界的细菌和真菌等生物中。它在工业上具有许多潜在的应用价值。本试剂盒采用对硝基酚-α-鼠李糖苷(PNPR) 作为底物，生成黄色的对硝基苯酚(PNP), 该产物在405nm处有大吸收峰。通过检测PNP在4 0 5nm下的增加速率，即可得到α-L-鼠李糖苷酶活性的大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下或离心使试剂落入底部，再加1.1mL蒸馏水溶解混匀,若难溶解可超声溶解。 |
试剂二 | 粉剂10mg×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、恒温培养箱、研钵、蒸馏水。
α-L-鼠李糖苷酶活性测定:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0 . 1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，4℃×12000rpm离心15min, 取上 清液待测。
注 : 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL提取液， 超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W, 超声3s, 间隔10s, 重次);12000rpm4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL) 为500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本：可直接测定，或者适当稀释后测定。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30 min, 调节波长为405nm。
② 所有试剂于40℃水浴中预热20 min。
③ 在9 6孔板中依次加入下列试剂：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 10 | 10 |
试剂一 | 20 | |
试剂二 | 70 | 90 |
迅速混匀,40 ℃保温20min 。 |
试剂三 | 100 | 100 |
混匀，5min后立即于405nm下读取吸光值A,△A=A测定-A对照(每个测定管需设一个对照管)。 |
注 :
① 若△A 的值非常低在零附近，可增加样本量 V1 (如增至20μL,则试剂二相应减少)或延长反应时间 T (如增至30min 或更长),则重新调整的 V1和T须代入公式重新计算。
② 若△A 的值超过1,则需要稀释样本，稀释倍数 D 代入计算公式；
结果计算：
1、标准曲线：
y=53.937x-0.0037,x 是标准品 (PNP)摩尔质量：μmol;y是△A。
2、按照样本质量计算：
酶活定义：
在40℃下，每克组织每小时水解1μmoLPNPR产生 PNP定义为1个酶活单位。
α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/g鲜重)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(W×V1÷V)÷T×D =5.56×(△A+0.0037)÷W×D
3、按照样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
在40℃下,每毫克蛋白每小时水解1μmoLPNPP产生 PNP 定义为 1个酶活单位。
α-L- 鼠李糖苷酶(μmol/h/mgprot)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(Cpr×V1)÷T×D=5.56×(△A+0.0037)÷Cpr×D
4、按细胞数量计算：
酶活定义：
在40℃下，每10⁴个细胞每小时水解1μmoLPNPP产生 PNP 定义为1酶活单位。
α-L- 鼠李糖 苷酶(μmol/h/10⁴cell)=[(4A+0.0037)÷53.937]÷(500×V1)÷T×D =0.011×(△A+0.0037)×D
5、按液体体积计算：
酶活定义：
在40℃下，每毫升液体每小时水解1μmoLPNPP产生PNP定义为1个酶活单位。
α-L- 鼠李糖苷酶(μmol/h/mL)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷V1÷T×D=5.56×(△A+0.0037)W-- - 样品质量,g;V--- 提取液体积,1mL;V1--- 上清液 体积 (mL),0.01mL;T---反应时间，20min=1/3h。D--- 稀释倍数，未稀释即为 1;Cpr--- 上清液蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的BCA蛋白 质含量测定试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（10μ mol /ml）：向标准品EP管里面加入1mL 蒸馏水溶解，若有结晶析出，需37℃水浴至完全溶解。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 μ mol/ml。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据 40ul 的标准品+360ul 的试剂二，再加 400ul 的试剂三，于 405nm 处读值；根据结果即可制作标准曲线。
